慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量对IL-12诱导PBMC产生Th1/Th2类细胞因子协同效应的影响

宋洁 邵雪 贾胜男

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B)是威胁现代人健康的一种常见疾病，其主要病因是HBV感染，严重者可危及患者生命，治疗的关键在于抗病毒治疗[1]。本病HBV DNA复制可干扰正常免疫系统功能，通过判断血清HBV DNA含量可对机体清除HBV的能力进行反映，进而研究其对干扰素效果的影响[2]。我院近年来研究发现慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量对IL-12(白细胞介素-12)诱导其PBMC产生Th1/Th2类细胞因子协同效应具有重要作用，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2017年1月至2018年6月我院收治的慢性乙型肝炎患者120例，对所有患者的血清乙肝病毒的脱氧核糖核酸(HBV DNA)含量进行测量，对不同血清HBV DNA含量的患者外周血单个核细胞(PBMC)产生Th1/Th2类细胞因子含量进行测量。纳入标准：(1)所有患者均符合慢性乙型肝炎相关诊断标准[3]；(2)所有患者均为住院患者或者是传染科门诊患者；(3)通过酶联免疫吸附实验检测患者的乙肝表面抗原(HBsAg)阳性持续时间>半年，ALT(丙氨酸转氨酶)水平>60U/L；(4)所有患者均知晓同意此次研究。排除标准：(1)伴随有其他恶性肿瘤的患者；(2)精神失常的患者；(3)临床资料不完整的患者。此次研究的患者为120例，男88例，女32例，年龄20～68岁，平均年龄(50.4±2.5)岁；所有患者一般资料具有存在可比性(P>0.05)，研究获得了我院伦理委员会审核与批准。

二、方法

外周血单个核细胞(PBMC)培养与因子检测：所有患者均在入院后的第二天清晨采集空腹静脉血13 mL，对其中的3 mL进行离心分取血清，后保存在-20℃的条件下，待检测。剩余10 mL在其中加入500单位的肝素进行抗凝，后应用凡影葡胺密度梯度法在2 h内对PBMC进行分离记数。在溶液中加入100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素、10%活小牛血清的RPMI1640完全培养液将浓度调整为1.0×106个/mL，后将其移入到48孔培养板内，分别在培养孔中加入抗原纯度>99%的重组HbeAg 1 μg/mL、重组HbcAg 1 μg/mL重组，由西安广华生物公司提供；加入100 pg/mL聚羟基脂肪酸酯(PHA)。抗原单独或者是与10 ng/mL IL-12联合放置在温度为37℃，5%的CO2孵箱中培养大约48 h,后对其进行离心分取血清，应用双抗体夹心ELISA法对IL-12(白细胞介素-12)、IFN-γ(γ-干扰素)、IL-4(白细胞介素-4)、IL-10(白细胞介素-10)因子含量进行检测，试剂盒由Genayme公司提供，在进行此项操作要严格按照说明书进行[4]。

血清乙肝病毒的脱氧核糖核酸(HBV DNA)含量检测：应用荧光定量PCR检测，试剂盒由中山医科大学提供，在进行此项操作时严格按照说明书进行。应用PE5700全自动分析仪对样品拷贝数值(M)进行自动的计算，1000×M= HBV DNA(基因拷贝数/mi)含量[5]。

丁型肝炎病毒(HDV抗体)、戊型肝炎病毒(HEV抗体)、丙型肝炎病毒(HCV抗体)、血清标本乙肝病毒标志物(HBVM)检测：应用ELISA法进行检测[6]。试剂盒由3V公司提供，在进行此操作时要严格按照说明书进行。

三、观察指标

分析所有慢性乙型肝炎患者HBV DNA含量检测结果。分析不同血清HBV DNA含量的患者外周血单个核细胞(PBMC)产生Th1/Th2类细胞因子含量。比较e抗原阳性患者与e抗原阴性患者PBMC产生的Th1/Th2类细胞因子含量。

四、统计学方法

结 果

一、所有慢性乙型肝炎患者HBV DNA含量检测结果分析

HBV DNA含量<103拷贝/mL的患者21例，在103～105拷贝/mL之间的患者37例，在105～107拷贝/mL之间的患者32例，>107拷贝/mL的患者30例。

二、不同血清HBV DNA含量的患者PBMC产生Th1/Th2类细胞因子含量分析

随着HBV DNA含量升高，抗原单独诱导或者是与IL-12一同诱导，PBMC产生Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ的含量不断下降，而Th2类细胞因子IL-4、IL-10的含量不断增高。抗原单独诱导与联合IL-12一同诱导相比较，随着HBV DNA含量升高，IL-12对PBMC产生的IFN-γ细胞因子协同效应不断下降，尤其对于>107拷贝/mL的患者基本无协同效应。对于<103拷贝/mL的患者，IL-12对HbeAg诱导PBMC产生的IL-4细胞因子有显著的抑制作用、在103～105拷贝/mL之间的患者，对IL-4细胞因子、IL-10细胞因子有显著的抑制作用，见表1，表2。

表1 不同血清HBV DNA含量的患者PBMC产生Th1类细胞因子含量分析(pg/mL，±s)

注：与血清HBV DNA<103对比，aP<0.05，bP<0.05；IL-12+PHA+HBcAg与IL-12+HBcAg+HBeAg比较，cP<0.05，dP<0.05。

三、e抗原阳性患者与e抗原阴性患者PBMC产生的Th1/Th2类细胞因子含量对比

e抗原阴性患者PBMC产生的IFN-γ、IL-4细胞因子高于e抗原阳性患者(P<0.05)，e抗原阴性患者PBMC产生的IL-10细胞因子含量低于e抗原阳性患者(P<0.05)，见表3。

表2 e抗原阳性患者与e抗原阴性患者PBMC产生的Th1/Th2类细胞因子含量对比(±s)

讨 论

通过检测慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA含量，可有效判断机体对HBV的清除功能。本次研究结果提示，随着HBV DNA含量升高，抗原单独诱导或联合IL-12诱导时，PBMC产生Th1类细胞因子的含量不断下降，而Th2类细胞因子的含量不断增高。随着HBV DNA含量升高，IL-12对PBMC产生的IFN-γ细胞因子协同效应不断下降，尤其对于>107拷贝/mL的患者基本无协同效应；对于<103拷贝/mL、103～105拷贝/ml的患者，对Th2类细胞因子有显著的抑制作用。

结果分析，IL-12可增强Th1类、抑制Th2类细胞因子的免疫应答；而HBV DNA复制可引发体液免疫反应，并发诱导正常肝细胞产生炎性反应，进而不断破坏肝组织，造成病情迁延难愈[7]。临床干预中若抑制HBV DNA复制，有利于改善细胞免疫功能，增强IL-12对Th1类细胞因子的协同效应，抵抗乙型肝炎病毒[8]。

综上所述，慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA含量升高会抑制IL-12对Th1类细胞因子的协同效应，治疗中降低血清HBV DNA含量可显著增强此协同效应，建议行进一步大样本量研究及临床推广。