不同波长和标准品对红三叶异黄酮含量测定的影响

李勇胜，蔺永和，杨 琴，刘 权

（兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 / 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 /兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020）

红三叶(Trifolium pratense)，又名红车轴草、红花苜蓿等，是一种分布范围广的优良豆科牧草[1]。红三叶中含有大量异黄酮类化合物[2]，具有良好的抗氧化、清除自由基活性，可用作治疗百日咳、哮喘、湿疹、眼部疾病、癌症、镇痉、祛痰、止痛[3]等病症，常作为功能食品或膳食补充剂[4-5]。作为少数几种富含植物雌激素的植物，越来越多地应用于临床中改善和治疗妇女更年期综合症，以及预防骨质疏松、乳腺癌、心血管系统疾病等。由于植物药毒性低、靶点多、不易产生抗药性等众多优点，红三叶提取物已被制成多种剂型，其销量在美国多年来一直名列植物药的前10位[6]。此外，红三叶异黄酮对其他植物生长具有明显的抑制作用，是该植物抗逆和种群竞争的物质基础[7-8]，具有重要的生态功能。

异黄酮含量是红三叶育种、种植管理及提取和纯化工艺优化等过程的重要指标。目前测定方法主要为紫外分光光度法和高效液相色谱法[9-11]。两种方法都是利用异黄酮化合物紫外吸收的原理，但测定方法差别较大，适用范围不尽相同。高效液相色谱法精确度高，可以测定单个异黄酮化合物的含量，但需要标准品较多，操作繁杂，耗时长，测试成本高，多用于异黄酮单个组分的精确分析[9,12-13]。用高效液相色谱法也可以测定红三叶异黄酮的总含量，但往往只是其中部分异黄酮成分含量的总和，存在较大的系统误差。生产实践中，常常需要对红三叶异黄酮总量进行定量。目前已经报道的红三叶异黄酮有40多种[14]，仍存在一些未知的组分。紫外分光光度法对标准品数量要求较低，一般1～2个就可以，速度快，灵敏度高，测试成本低，特别适合大量样品定量、半定量的测定，在异黄酮的研发中有大量应用[14-17]。对于紫外分光光度法而言，影响其测定精度的主要因素有测定波长、溶剂以及标准品的选择[15]。为了不断提高红三叶异黄酮含量测定精度，很多学者开展了大量的研究工作：陈寒青和金征宇[16]建立了三波长紫外分光光度法，张晓松等[15]采用等吸光点紫外分光光度法。然而这些方法都需要建立在标准品的科学选择上，标准品的选择同时也会改变测定波长等其他因素。

图1 红三叶中4种主要异黄酮成分Figure 1 Four isoflavone compounds in red clover

红三叶异黄酮中含量较高的主要是芒柄花素(formononetin，以下简称F)、鹰嘴豆素A (biochanin A，以下简称B)、染料木素(genistein，以下简称G)和大豆苷元(daidzein，以下简称D) 4种异黄酮成分[9-14](图1)。目前，利用紫外分光光度法对红三叶中异黄酮的含量进行标定和检测中多采用1种标准品，以鹰嘴豆芽素A[11,16,18-23]、芒柄花素[14,24-26]、大豆苷元[27-28]或染料木素作为标准品[29]。有少数研究采用2种标准品进行标定，例如用芒柄花素和鹰嘴豆素A组合[15]，用大豆苷元和染料木素组合作为标准品[30]。还有学者用芦丁作为标准品进行测定[6]。但是关于红三叶异黄酮含量测定的标准品如何选择及所带来的误差鲜见报道。因此，本研究将4种异黄酮成分作为标准品，分别在240、249、254、260和275 nm对红三叶材料进行测定，并分析测定结果，以期为建立更准确的红三叶异黄酮检测方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料：2017年7月初采自甘肃省岷县种植的红三叶的地上部分，分别命名为样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。

试剂：鹰嘴豆素A标准品(含量 ≥ 98%)、芒柄花素标准品 (含量 ≥ 98%)、染料木素 (含量 ≥ 98%)、大豆苷元标准品(含量 ≥ 98%)、甲醇(色谱级)均购于北京伊诺凯科技有限公司。

设备：UV-1600型紫外可见分光光度计(日本岛津)。

1.2 方法

1.2.1 红三叶样品待测液的制备

称取植物样品0.20 g，加入8 mL甲醇，超声提取30 min。提取液4 000 r·min-1离心10 min后，取上清液，通过0.45 μm有机膜过滤，制备待测液。将样品I～V每个样品重复提取3次。

1.2.2 紫外吸收分光光度法

分别准确称取芒柄花素、鹰嘴豆素A、染料木素和大豆苷元标准品，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，然后依次稀释，得到一系列标准品溶液，然后在波长为190～600 nm的波长范围内进行光谱扫描。芒柄花素和大豆苷元在249 nm处有最大吸收，染料木素在259 nm处有最大吸收，鹰嘴豆素A和红三叶样品待测液的最大吸收值在261 nm (图2)。本研究分别选择240、249、254、260和275 nm作为测定波长。

以甲醇为空白对照，分别于240、249、254、260和275 nm波长处测定吸收值，绘制标准曲线并计算线性回归方程，计算红三叶异黄酮含量。

鹰嘴豆素A：Y240= 59.902X+ 0.204 2 (R2= 0.998 2)；Y249= 92.871X+ 0.205 5 (R2= 0.999 3)；Y254= 118.17X+0.205 4 (R2= 0.999 7)；Y260= 140.55X+ 0.206 8 (R2=0.999 9)；Y275= 71.516X+ 0.210 3 (R2= 0.999 6)。

大豆苷元：Y240= 103.44X+ 0.223 3 (R2= 0.999 5)；Y249= 114.13X+ 0.221 9 (R2= 0.999 9)；Y254= 104.71X+0.224 9 (R2= 0.999 7)；Y260= 102.27X+ 0.222 3 (R2=0.999 9)；Y275= 65.761X+ 0.222 2 (R2= 0.999 7)。

芒柄花素：Y240= 103.1X+ 0.202 3 (R2= 0.999 7)；Y249= 112.42X+ 0.205 1 (R2= 0.999 7)；Y254= 105.95X+0.206 2 (R2= 0.999 7)；Y260= 100.15X+ 0.208 4 (R2=0.999 8)；Y275= 61.955X+ 0.209 9 (R2= 0.999 7)。

染料木素：Y240= 59.315X+ 0.213 8 (R2= 0.999 2)；Y249= 93.256X+ 0.212 6 (R2= 0.999 7)；Y254= 118.53X+0.212 3 (R2= 0.999 7)；Y260= 142.71X+ 0.212 5 (R2=0.999 9)；Y275= 71.06X+ 0.215 9 (R2= 0.999 7)。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0软件分别对同一样品不同标准品所测定的异黄酮含量进行单因素方差分析，并用Duncan法对各测定数据进行多重比较；利用Excel 2007制作图表。

2 结果与分析

2.1 红三叶异黄酮的紫外分光光度法分析结果

即使是用同一种标准品，红三叶提取物在240、249、254、260和275 nm测定的结果也相差非常大(表1)。根据其化学结构(取代基数量和位置)和紫外吸收曲线，红三叶的4种主要异黄酮成分可以分为两组：FD组为芒柄花素和大豆苷元，BG组为鹰嘴豆素A和染料木素(图1、图2)。

在波长 ≤ 249 nm时，BG组测定的含量高于FD组(表1)。在240 nm处，标准品B和G的紫外吸收曲线处于波谷位置，特别是标准品B，吸收强度低，导致测定结果偏高，也说明波长对测定结果的影响较大(表1)。在254 nm下，所测定的异黄酮含量浓度从大到小依次为 F ＞ D ＞ B ＞ G，这与 240和249 nm规律不一致，F和D之间、B和G之间差距较小，但两组之间数值差距较大(表1)；260 nm的变化规律与254 nm基本一致，但FD组测定的含量高于254 nm，BG组含量低于254 nm，组间差距较254 nm增大(表1)；275 nm的变化规律与254、260 nm的相同，但是D、B和G这3种标准品测定的含量之间差值较小(表1)。这是由于同浓度的D、mg·g-1B和G的紫外吸收曲线在275 nm处有交叉，吸收强度接近，而F在此处吸收强度相对较弱，故测得的含量较高。在本研究选定的5个波长下，组内B测定的含量大多高于G，F测定的含量大于D，但同组内没有显著性差异。波长大于等于249 nm时，同一标准品所测得红三叶异黄酮含量大多在275 nm处是最高值。

表1 不同标准品所标定的红三叶异黄酮含量Table 1 Isoflavone content in red clover extracts by using different standards

此外，同一个红三叶样品，不同波长或不同标准品进行标定的含量差异非常大。例如样品Ⅱ的含量最低为10.23 mg·g-1(260 nm下，染料木素为标准品)，最高为17.07 mg·g-1(275 nm下，芒柄花素为标准品)。但是，如果只是比较含量的相对大小，则不同波长或不同标准品，对含量高低排序影响不大。5个样品中异黄酮含量顺序均为样品Ⅴ ＞ 样品Ⅱ ＞样品Ⅰ ＞ 样品Ⅲ ＞ 样品Ⅳ。

3 讨论

异黄酮是红三叶植物主要的次生代谢物，具有重要生态功能与药用价值。异黄酮含量的准确测定对于该植物的研究和应用都非常重要。生产实践中，分光光度法是对该植物异黄酮总含量测定的主要方法之一，被广泛采用。本研究表明，不同波长和标准品对异黄酮含量测定影响非常显著，然而这在之前却未见报道。

根据含量测定结果，作为含量检测标准品的4种主要异黄酮化合物大体可分为两组：FD组和BG组。组内差异较小，组间差异较大(表1)。虽然4个化合物骨架均为黄酮结构，但F和D为7位羟基和4'位氧取代的结构，而B和G位为5、7位羟基和4'位氧取代的结构(图1)。这也解释了组内紫外吸收曲线相似度较高，测定含量较为接近的原因。

据文献报道，很多波长均被应用到红三叶异黄酮的检测中[15-16,18-29]，但未见对其所引起的误差进行比较研究和报道。通过观察紫外吸收曲线，4个标准品化合物和红三叶提取物在275 nm处有交叉，吸收强度差距小，而且曲线斜率也较为接近(图2)。在275 nm处比较不同标准品的测定准确度更为科学合理。在275 nm所处得到的结果中，标准品F测定含量较高。特别是样品Ⅰ和Ⅴ，F所测定含量与其他标准品差异显著(P＜ 0.05)。基于本研究结果，建议利用B或G为标准品，在275 nm处测定红三叶异黄酮含量更为准确，两个化合物测定结果数值接近，且无显著差异(表1)。然而关于用B或G，还是混合使用的标准品使用方法，还需要进一步的深入研究和探讨，特别是需要大样本的积累。本研究结果可以为测定异黄酮含量时提供一个较为理想的参考初始值，虽不能给出一个精确的测定方案，但将有助于提高总异黄酮含量测定的准确度，而且希望通过本研究引起学界对标准品和波长选择所带来系统误差的重视。

一般认为，利用植物体内含量较高的成分作为标准品进行表征，会提高紫外分光光度法的测定精度。红三叶异黄酮含量会因生长环境、生理阶段、采集部位甚至是样品处理方式的不同引起其中成分与含量的变化[3,10,12-13,18]，同一种异黄酮成分在不同红三叶样品中的含量不同，同一个植物样品中不同异黄酮成分含量也有差异，本研究结果中，利用不同化合物作为标准品，均未改变样品异黄酮含量的大小关系。标准品在植物的含量高低，与所测定结果关系并不密切。此外，本研究发现不同波长对半定量或定性比较异黄酮含量影响也较小。因此虽然不同文献中不同测定方法得到的红三叶异黄酮含量的绝对值，直接进行比较可能存在一定误差。但是本研究利用不同波长和标准品对红三叶异黄酮含量的排序却是可靠的，所得到的结论及优化的提取纯化工艺等是可行的[20,25,27]。