Fhl1 基因敲除对不同年龄小鼠腓肠肌肌纤维分化和自噬水平的影响

苗佳宁, 刘 波, 丁晶晶, 王莉莉

(中国医科大学附属盛京医院实验研究中心, 沈阳110004)

(辽宁省环境与代谢疾病动物模型研究与应用重点实验室, 沈阳110004)

FHL1(Four and a half LIM domains protein 1)属于LIM 蛋白家族成员之一。人类FHL 的LIM 蛋白家族包括5 个成员，FHL1、FHL2、FHL3、FHL4 和FHL5[1-4]。人类Fhl1 基因位于Xq27.2, 含有5 个外显子，cDNA 全长2 441 个碱基，编码280个氨基酸[5,6]。 FHL1在骨骼肌和心肌中高水平表达，在细胞骨架重排、纤维形成和肌小节的组装中发挥一定作用[7-9]。近年研究[10-12]表明，Fhl1是人类6 种X 连锁肌病的致病基因，包括： X 连锁遗传性的肩腓型肌病、X 连锁姿势性肌肉萎缩型肌病、X 连锁的还原体肌病、埃-德二氏肌营养不良、X 连锁退缩性的埃-德类似综合征和脊柱强直综合征。除了上述的X 连锁肌病外, 有研究[13]表明Fhl1基因的表达下调和先天性马蹄内翻足的肌肉异常表型的形成有关。此外, 在部分特发性炎性肌病的患者体内出现FHL1抗体, 引起骨骼肌自身免疫性损伤, 导致患者肌肉萎缩, 发音、吞咽困难[14]。因此, FHL1 对骨骼肌发育起到重要作用，Fhl1 基因的突变和表达异常可以引起各种肌肉表型异常。探讨Fhl1基因敲除(FHl1-ko)小鼠骨骼肌表型的分子机制将为揭示人类FHL1肌病的发生机制奠定一定基础。因此，课题组前期应用TALEN 技术制作了Fhl1-ko 小鼠, 并且发现2.5 月龄的Fhl1-ko小鼠胫骨前肌中肌原纤维和肌原纤维间的排列紊乱和Foxo1 介导的自噬水平和mTOR激活的蛋白合成有关[15]。Fhl1-ko 对不同年龄小鼠腓肠肌肌纤维分化和自噬水平的影响, 目前尚未见报道。因此, 本研究探讨了Fhl1-ko 对2.5 月龄(青年)和8月龄(成年)小鼠腓肠肌中自噬水平和肌纤维类型的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

TALEN 技术制作的Fhl1-ko C57B6 小鼠，具体制作过程和基因型鉴定方法见文献[15]。野生型(wt)C57B6雄性小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司[SCXK(辽)2015-0001]。wt 型和Fhl1-ko 型雄性C57B6小鼠饲养于中国医科大学附属盛京医院实验中心SPF 级动物饲养室[SYXK(辽)2017-0004]。

1.2 主要仪器设备和试剂

S1000Thermal cycler PCR 仪(美国Bio-rad 公司)，LightCycler 480 II 荧光定量PCR 仪(瑞士Roche 公司)，SynergyH1 全功能微孔板检测仪(美国BioTek 公司)，Amersham Imager 600 化学发光成像系统(日本GE 公司)。

TRIZOL(美国Invitrogen 公司)，反转录试剂盒、SYBR 染料(日本Takara 公司)，总蛋白提取试剂盒(美国Invent 公司)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒、化学发光检测试剂盒(美国Thermo 公司)，GAPDH抗体 (中国上海康成公司)， LC3B抗体(美国CST 公司)，Beclin1 抗体(英国Abcam 公司)，P62 抗体、FHL1 抗体(瑞士Sigma 公司)。

1.3 Western blotting

2.5 月龄和8 月龄的wt 型和Fhl1-ko型雄性小鼠各5 只, 小鼠麻醉后切取腓肠肌。应用Invent 总蛋白提取试剂盒提取30 mg肌组织的总蛋白, 具体操作步骤参照试剂盒说明书。应用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测提取蛋白质浓度, 应用12.5%的SDSPAGE 进行蛋白质的凝胶电泳。Western bloting 所用的一抗稀释比例如下GAPDH (1∶10 000), LC3B(1∶1 000), Beclin1(1∶500)，P62(1∶500)，FHL1(1∶2 000)。

1.4 定量PCR

用T R IZ O L 试剂提取各组小鼠腓肠肌总RNA。用反转录酶和 Oligo(dT)20 引物合成cDNA。定量 PCR 的引物序列见表 1。在定量PCR 过程中，每个基因重复扩增 3 次， 基因的相对表达水平应用 2－△△Ct方法计算。PCR 产物经 2%琼脂糖胶电泳分离并拍照。

2 结果

2.1 不同基因型的小鼠鉴定结果

鼠尾基因组DNA经PCR扩增后，直接测序。不同基因型的小鼠基因组DNA 测序结果见图1。

2.2 不同月龄Fhl1-ko 小鼠腓肠肌自噬水平变化

与2.5 月龄wt 的小鼠腓肠肌相比，2.5 月龄Fhl1-ko 小鼠腓肠肌肌中LC3B 和Beclin 1 明显增加，P62 却并没有明显降低。而与8 月龄wt 小鼠的腓肠肌相比, 8 月龄Fhl1-ko 小鼠腓肠肌中LC3B明显增加, 但是增加的幅度没有2.5月龄小鼠中明显。同时, 8月龄Fhl1-ko小鼠腓肠肌中Beclin1表达水平改变没有统计学意义, P62 的表达水平明显增加(图2)。

表 1 定量PCR 引物序列

wt 为野生型小鼠, ko 为Fhl1-ko 型小鼠； 下图同图 1 不同基因型的小鼠鼠尾基因组DNA 测序鉴定结果

2.3 不同月龄Fhl1-ko 型小鼠腓肠肌肌纤维相对表达量

2.5月龄小鼠中, Fhl1-ko可以明显降低腓肠肌中MYH IIA, MYH IIX 型肌纤维相对表达量，明显增加MYH IIB 型肌纤维相对表达量, 而Fhl1-ko对青年鼠腓肠肌中MYHI 型肌纤维相对表达量并没有影响。在8 月龄小鼠中，Fhl1-ko 可以明显增加腓肠肌中MYHI和MYH IIA型肌纤维相对表达量，而对MYH IIX 和MYH IIB 型肌纤维相对表达量没有影响(图3)。

3 讨论

图 2 不同月龄Fhl1-ko 型小鼠腓肠肌自噬水平变化

细胞自噬是真核生物对细胞内物质进行代谢和更新的重要过程，在小鼠发育的不同阶段, 自噬水平和骨骼肌中肌纤维类型是动态变化的。在前期研究[15]中，我们发现2.5 月龄的Fhl1-ko 小鼠的胫骨前肌、肱三头肌、腓肠肌(糖酵解型的II纤维组成)中自噬水平明显增加，同时Fhl1-ko 可以明显增加胫骨前肌中MYHI 型肌纤维含量，减少MYHXII型和MYHIIB型肌纤维的含量。但是，Fhl1-ko对不同年龄小鼠自噬水平和肌纤维分化的影响, 目前尚不清楚。因此, 本研究探讨了2.5 月龄(青年小鼠)和8月龄(成年小鼠)Fhl1-ko小鼠腓肠肌中自噬水平和肌纤维相对表达量的变化。结果表明, Fhl1-ko 可以明显激活青年小鼠(2.5 月龄)腓肠肌中Beclin1 介导的自噬水平，自噬流有受阻的表现(自噬激活时，P62 的降低是自噬流通畅的标记。2.5 月龄的Fhl1-ko 小鼠腓肠肌中自噬明显激活，但P62 并没有降低)。而Fhl1-ko 后对成年小鼠(8 月龄)的自噬激活没有青年鼠明显。不同年龄, 不同物种的骨骼肌中自噬水平变化的研究结果并不一致。有研究[16]表明, 与7～8 月龄的成年大鼠相比，老龄大鼠(24～26 月龄)的比目鱼肌和腓肠肌中虽然自噬的上游通路激活，但其基础自噬水平降低。然而，在犬类的研究中却发现老龄犬的骨骼肌中有 LC3 II 和Beclin 1的激活, 提示自噬水平的增加是衰老性肌萎缩的原因之一[17]。在研究衰老对Fischer 344 大鼠跖肌肌肉组织中自噬和凋亡的影响时发现, 自噬调节蛋白Beclin-1在 衰老的跖肌肌肉组织中表达上调[18]。本文结果提示,Fhl1-ko 对青年小鼠(2.5 月龄)和成年小鼠(8 月龄)腓肠肌中自噬与自噬流的影响不同。有研究[19]表明，骨骼肌组织中特异肌纤维的含量受年龄影响。与老龄鼠相比，3 月龄的青年大鼠的比目鱼肌中MYHIIA 型肌纤维含量较高，MYHI 型肌纤维含量较少。小鼠的腓肠肌的肌肉质量在7 月龄时达到峰值, MYH IIA 型肌纤维含量、肌纤维大小和肌肉的收缩能力在8 月龄时达到峰值[20]。

图 3 不同月龄Fhl1-ko 型小鼠腓肠肌肌纤维相对表达量

在青年鼠中，Fhl1-ko 可以明显降低腓肠肌中MYH IIA, MYH IIX 型肌纤维相对表达量, 同时明显增加MYH IIB 型肌纤维相对表达量, 而Fhl1-ko对2.5月龄腓肠肌中MYHI型肌纤维相对表达量并没有影响。在成年鼠中，Fhl1-ko 可以明显增加腓肠肌中MYHI 和MYH IIA 型肌纤维相对表达量，而对MYH IIX 和MYH IIB 型肌纤维相对表达量没有影响。本文结果表明，Fhl1-ko 对青年小鼠(2.5月龄)和成年小鼠(8月龄)腓肠肌中肌纤维的含量影响不同，提示Fhl1-ko 对不同年龄小鼠骨骼肌收缩能力的影响是不同的。

自噬在维持骨骼肌功能中发挥重要作用，有研究[21]表明，通过调节自噬信号通路可以作为治疗年龄相关的少肌症的潜在治疗手段。本文结果表明，Fhl1-ko 对青年小鼠(2.5 月龄)和成年小鼠(8 月龄)腓肠肌中自噬的影响不同。提示调节自噬水平可能是FHL1 基因突变和蛋白缺失所致的骨骼肌肌病的潜在治疗手段，并且针对不同年龄段的患者应采用差异化的精准治疗手段。