近交系中国仓鼠遗传质量标准的建立

2019-09-02续国强高继萍刘茂林陈朝阳宋国华

实验动物与比较医学 2019年4期

续国强, 高继萍, 刘茂林, 陈朝阳, 宋国华

(山西医科大学实验动物中心, 实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室, 太原030001)

中国仓鼠(Cricetulus griseus)，俗称中国地鼠,已广泛应用于遗传学、肿瘤学、生物医学等诸多领域。它的双侧颊囊薄，易于翻出且血管丰富，在肿瘤移植、各种口腔疾病研究及微循环研究中优势突出[1]。中国仓鼠基础研究薄弱、标准化资料相对较少，至今尚未有适用于中国仓鼠的遗传质量标准，严重阻碍了近交系中国仓鼠的推广和应用。本研究以国内外大量相关文献为基础，哺乳类实验动物遗传质量控制GB14923-2010[2]为参照，群体遗传学理论为依据，制定了中国仓鼠遗传质量标准。近交系中国仓鼠遗传质量标准的建立不仅使近交系中国仓鼠的遗传质量有据可依，为将来建立中国仓鼠遗传信息库奠定了基础；而且使我国实验动物质量标准体系进一步完善和发展，为将来制定动物源性生物药物质量标准提供借鉴；可在很大程度上保证科研数据的可靠性、一致性和可重复性，对提升我国实验动物科学自主创新的研究水平，进而提高我国在实验动物领域的国际地位也具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1 建系与繁殖

山西医科大学薄家璐教授分别于1980 年和1981 年从北京郊区购回两批野生中国仓鼠，经模拟自然环境及笼养两个阶段后成功培育出四个家系；由于近交衰退，保种至今的只有A 家系和E家系[3](山医群体)。经权威部门检测认证, 该群体已达到近交系标准[4]。

1.2 命名

参照国家质量监督检验检疫总局、国家标准委员会批准的实验动物国家标准GB14923-2010并根据群体遗传学理论制定。

1.3 建立检测方法

近交系中国仓鼠遗传质量检测采用微卫星标记法。

1.3.1 微卫星DNA富集文库的构建利用中国仓鼠尾组织提取基因组DNA，随后将其超声打碎，选择长度在500～1 000 bp的DNA片段进行末端补平。将形成平末端的基因组DNA沉淀浓缩并利用QIAquick 试剂盒回收后, 用电泳法检测其回收浓度。把回收的DNA 与接头以1∶100 的比例混合于10 μL 反应体系, 14 ℃连接, 70 ℃灭活。然后将连接好的DNA 与DNA 的解链温度(Tm)值相近的探针杂交后, 通过链霉亲和素包被的磁珠进行富集。将富集的微卫星DNA片段插入到pGEM-T载体上后转入DH10B大肠杆菌，构建中国仓鼠微卫星DNA 富集文库，取阳性克隆进行测序。

1.3.2 微卫星引物的设计与筛选应用软件Tandem Repeats Finder 查找重复序列，软件Vec Screen 去除载体序列，软件Consed 及Phrep 等进行拼接，利用软件Primer 3.0 设计引物135 对。从这135 对引物中挑选易产生多态性的目标引物订购合成。使用目标引物对中国仓鼠DNA进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物多态性进行筛选。对多态性良好引物的正向链进行荧光标记。用标记的引物对组织DNA进行PCR扩增, PCR产物经纯化后进行STR 扫描，然后对其基因型进行判读。从微卫星富集基因组DNA文库中, 分离鉴定了17个新的微卫星位点并对其进行了分析。

2 近交系中国仓鼠遗传质量标准

2.1 定义

通过全同胞兄妹交配或亲子交配培育，且最少持续20代，全部个体均有一对共同祖先来自于第20 代或其以后代数的品系称为近交系[5]。

2.2 命名

近交系中国仓鼠严格按照小鼠标准化遗传命名国际委员会制定的命名法及中华人民共和国GB14923-2010 标准命名。

2.3 繁殖

近交系中国仓鼠繁殖方法的选用原则是, 在不发生遗传污染和保持其同基因性的条件下, 利用近亲繁殖尽可能提高品系的纯合度，使其近交系数无限接近100%。无论是引进还是自己培育，一般均采用单线法、平行线法及优选法中的一种。

引种：作为繁殖原种的近交系中国仓鼠不仅要符合我国实验动物管理相关规定，还应有完善的品系名称、生物学特性、育种单位和遗传背景等资料且来源清楚[6]。

交配：在群体中挑选3月龄个体进行全同胞交配。每日均对仓鼠种群进行发情周期检测，挑选发情期母鼠合笼交配。近交系中国仓鼠供应群及扩大群中任意个体均在核心群中有5 代以内的共同祖先，核心群还可根据相应的选育目的，根据其生物学、遗传学等特性挑选与配种，且尽可能选用综合优选法进行配种。

交配后管理：中国仓鼠独居生存、性情残暴，繁殖过程中往往发生撕咬造成雄鼠损失，所以要对其交配进行实时监测，交配动作一经完成，即检查雌鼠阴道栓，及时分笼饲育。

2.4 遗传质量监控

2.4.1 遗传质量标准近交系中国仓鼠必须符合下列要求： ①除具有个体性、同基因性、基因纯合性、遗传稳定性、分布的广泛性及背景资料可查性等特性外，所引种或培育的近交系中国仓鼠还需完全符合近交系定义的规定； ②近交系的生存环境安全舒适，繁殖方法科学合理，生产保种记录卡保存完整、清晰可查； ③经微卫星标记遗传质量检测法检测，质量合格。

2.4.2 检测方法及具体实施 ①检测方法：近交系中国仓鼠遗传质量检测选用微卫星标记检测法。具体方法按附录1 进行； ②取样：采用随机取样的方法，随机从各饲养笼盒中选取成年仓鼠； ③结果的判定：可用Gene Marker V 1.6 对STR 的扫描结果进行判读，近交系中国仓鼠基因型为纯合子，无杂峰且峰型均匀； ④检测间隔：任意时间、任何动物都可能发生自发突变，因而近交系动物遗传质量检测的时间间隔一般不宜超过2 年。

3 讨论

3.1 制定标准的迫切性和意义

中国仓鼠原产于我国黄河以北地区，全身被毛。它具有染色体大、易于辨认且数量较少的特点，在细胞遗传、辐射遗传、分子生物等领域的应用尤为广泛[7]。中国仓鼠山医群体近交系由于近亲交配而患有与人类Ⅱ型糖尿病类似的自发遗传性糖尿病，群体发病率在20% 左右，是研究糖尿病预防、治疗及预后理想的人类疾病动物模型；其雄鼠睾丸下垂且硕大，适于微生物寄生，是理想的病原体接种器官；除心电图波形与人类大体一致外，它血液中血红蛋白、红细胞、网织红细胞、白细胞、血清蛋白等含量也与人类相近，更是各类医学实验极佳的实验动物模型。国外于1940年代末将中国仓鼠引入实验室进行研究与繁殖[4]。我国张昌颖、李宏广等学者曾先后对其进行了培育和驯化, 但由于未突破其近亲衰退等限制未能延续。直至1980 年代初期，山西医科大学薄家璐教授等从北京购回两批野生中国仓鼠, 并对其进行驯养和繁殖；经过模拟自然环境和笼养两个阶段, 成功将其培育成符合国际标准的近交系实验动物。一直以来, 学者们主要集中于对中国仓鼠繁殖、保种、生物学特征、遗传标记、染色体核型等方面的研究。其分子进化、标准化特别是遗传质量标准化的研究尚属空白[8], 目前尚没有关于中国仓鼠遗传质量标准化的国家或地方标准。因此, 提供可靠的中国仓鼠遗传背景数据,建立中国仓鼠遗传质量标准就显得极为迫切。建立近交系中国仓鼠遗传质量标准, 规范中国仓鼠的繁殖、保种及应用, 将进一步完善我国实验动物的质量标准体系, 为建立更加完善和全面的实验动物遗传质量控制标准和技术标准奠定基础。

3.2 选择微卫星标记检测法的优势

微卫星序列是指存在于真核生物基因组中，以1～6个核苷酸为单位，经多次串联重复形成的简单重复序列，其长度约为100 bp，是研究分子进化、构建遗传图谱、诊断遗传疾病常用的分子标记。选用微卫星标记检测中国仓鼠的遗传质量具有诸多优势，如在真核生物基因组中大约每隔10～50 kb 就存在一个微卫星, 它不仅存在于非编码区还存在于外显子染色体上的任意区域；微卫星标记通常不具表型效应，故对动物个体不造成伤害且无次级效应。微卫星标记为共显性遗传，能够对动物基因纯合子和杂合子进行很好地区分。此外，微卫星位点一般采用先扩增，再测序分离的检测方法。可同时对多个微卫星位点进行检测且检测耗时短，一般一次检测可在1 d 内完成[9]。

3.3 关于近交系中国仓鼠遗传质量检测方法及结果分析

该标准提出了使用微卫星标记检测近交系中国仓鼠的遗传质量。目前, 可用于实验动物遗传质量检测的方法有生化标记法、形态学方法、免疫学方法等。基于微卫星位点数量庞大、多态性丰富, 检测方法快速简便，检测结果稳定可靠，被国内外专家学者一致认为是动物遗传质量检测的最佳分子标记，因此该标准决定选用微卫星标记技术来检测中国仓鼠的遗传质量。构建微卫星富集文库及设计筛选微卫星引物时[10], 利用超声打碎、凝胶电泳回收、SNX 接头连接、PCR 扩增、链亲和素耦联磁珠亲和捕捉、感受态大肠杆菌转化等成功构建了中国仓鼠微卫星DNA 富集文库。通过查找重复序列、去除载体序列、拼接目的序列、引物设计、引物挑选、PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选等步骤成功筛选出适合于中国仓鼠微卫星DNA的特异性引物。最终, 从中国仓鼠微卫星富集DNA文库中,分离鉴定了17个新的近交系中国仓鼠微卫星位点并对其进行了分析。

理论上，采样数越多，群体遗传质量检测结果就越准确可靠[11]。但过多采样，不仅浪费了人力物力、增加了检测成本，还缺乏一定的可操作性。故本标准从实际出发，制定了每个群体至少抽样30只个体进行检测的标准。近交系数是评价近交系群体的关键指标，近交系数越接近100%近交系质量越好；且近交系个体的基因型应均为纯合子，所有被测样品检测位点的等位基因都应符合品系特征，没有新的等位基因出现为合格的近交系中国仓鼠，否则判为不合格。

附录1 (规范性附录) ：

近交系中国仓鼠的微卫星标记检测方法

1 基因组DNA 的提取

用苯酚氯仿法或相应的试剂盒提取近交系中国仓鼠的基因组DNA。检测A260/A280值在1.8 左右的基因组DNA 进行后续试验。

2 微卫星位点

从附表1中随机挑选10个微卫星位点，对近交系中国仓鼠的遗传质量进行检测。

3 PCR 扩增

3.1 PCR扩增体系 PCR反应的总体积为10 μL：10 ng/mL 模板： 0.8 μL； 1pmol/L 上、下游引物：各0.1 μL； 5 U/μL Taq DNA 聚合酶： 0.1 μL； 2.5 mmol/L dNTPs 0.7 μL； 25 mmol/L Mg2+： 0.8 μL； 10×Buffer 1.0 μL； dd H2O 6.4 μL。

3.2 PCR 扩增程序 94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s；退火(具体温度见附表1)30 s； 72 ℃延伸45 s； 30 个循环后72 ℃延伸7 min。

3.3 PCR扩增产物检测 PCR扩增反应结束后, 取3 μL扩增产物于2% 琼脂糖凝胶中, 电泳检测产物。

3.4 PCR扩增产物扫描 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，微卫星引物标记的荧光种类是正向链的5’端蓝色荧关标记(FAM), 内参是GeneScanTM-500 LIZTM。取3～5 μL PCR 产物于384 孔板中，加入8 μL 含有内标的Loading Buffer(去离子甲酰铵)，上机STR 扫描。