食蟹猴急性心肌梗死模型的建立及护理

王成舟

(1. 浙江大学医学院附属第二医院科研部, 杭州310009； 2. 浙江大学, 杭州310029)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)模型是以结扎冠状动脉，达到部分心肌组织因急性缺血缺氧导致心肌组织细胞死亡，类似人类AMI 临床事件的模型特点。在动物非临床试验的心肌梗死模型中，常见以小鼠、大鼠、兔、猫、犬、小型猪为报道多见，随着在低等实验模型中取得的成就，越来越需要高等非人灵长类心肌梗死模型的出现。在非人灵长类动物中食蟹猴较比猕猴以身体体型小、来源丰富、易于驯化等优势，也渐渐被研究科学工作者选定为理想的高等动物实验模型。食蟹猴(Macaca fascicularis), 是与人类最为接近的物种之一，在生理学、解剖学、免疫学以及神经学等方面有很高的相似度，在生物医学研究领域也是比较理想的实验动物，利用其建立的动物模型被广泛用于研究人类疾病,如在传染病、心血管疾病、内分泌疾病、生殖疾病、神经疾病及眼疾病等方面，对比欧美发达国家，中国具有相当丰富的灵长类动物资源提供国内外应用[1]。用食蟹猴建立的人类疾病动物模型有利于观察疾病及其并发症的发生发展规律，同时为治疗药物的疗效检验和医学研究提供可靠的保证，而且，由于食蟹猴心脏解剖特点和生物学特性与人相似： 心脏体质量比例大，冠状血管粗大明显, 手术操作容易, 心脏局部缺血耐受性强，心脏有较强的抗心律失常能力，因此食蟹猴是心肌缺血试验理想的动物模型。然而，近年来食蟹猴心肌梗死模型的应用虽然是一种趋势，但是中文文献报道不多，故此，结合浙江大学附属第二医院萧山动物实验中心制备食蟹猴AMI建模的经验，总结出其建模流程、护理方法及注意要点。

1 造模?方法

1.1 实验动物

普通级5～6 周岁，体质量5～7 kg 雄性食蟹猴，由苏州西山中科实验动物有限公司[SCXK(苏)2012-0009]及广西防城港常春生物技术开发有限公司[SCXK(桂)2013-0004]提供。

1.2 实验条件

食蟹猴饲养在浙江大学医学院附属第二医院动物实验中心普通环境中[SYXK(浙)2014-0004]。单笼饲养, 饲养室温度(21±3) ℃, 相对湿度55%±15%，猴维持饲料(由北京科奥协力饲料有限公司提供)一日二餐饲喂，中间一餐水果，实验过程给予常规护理和人道主义的关怀。

1.3 主要实验仪器与耗材

美国Cardell 公司动物专用监护仪、VME 动物麻醉机、呼吸机(Matrx 3000)、威利高频电刀、除颤仪(Philips, Heartstart XL)、电动吸引器( 斯曼峰，Y X 9 3 0 D ) 、3 通道心电图仪(MIDMARK®，导联)。

1.4 造模手术前处理

1.4.1 术前准备 手术前列出清单, 逐一确认手术药品、急救药品、器材、耗品符合实验的要求，打开氧气瓶开关，确定气压表压力，确认氧气瓶中氧气是否充足，检查麻醉挥发罐中的异氟烷药物是否足够实验的需要，检查钠石灰的颜色是否需要更换，检查呼吸机气路畅通而且无漏气，手术台铺垫2 层一次性中单，整个手术室消毒液清扫后紫外灯过夜照射消毒。手术当日提前打开手术台温控开关，调节手术台温度在39～40 ℃。

1.4.2 食蟹猴麻醉 在实验前挑选健康雄性成年食蟹猴，并称量体质量，计算手术前诱导麻醉给药量。并在手术前12 h 开始禁水禁食。准备手术的食蟹猴通过肌肉注射0.2 mg/kg 米达唑仑、0.04 mg/kg 硫酸阿托品注射液及5 mg/kg 盐酸氯胺酮注射液诱导镇静。

1.4.3 麻醉后处理 待试验猴进入麻醉状态后, 对手术部位(左胸部)、电刀电极负极贴片位(背腹部)及相应的监测与皮肤接触部位进行剃毛处理。在试验猴小腿隐静脉安装留置针保留静脉滴注通路。80 万单位青霉素1 支溶解于100 mL 生理盐水中, 连接静脉通路进行滴注(保持在20滴/min左右), 同时配置2 μg/mL、5 μg/mL 肾上腺素备用。

1.5 手术造模

1.5.1 气管插管 将食蟹猴四肢绑定在手术台上，胸腔心脏部位正对无影灯最亮处，把2 颗上犬牙用绷带固定在手术台上沿，使食蟹猴头、颈、躯干在一条直线上，用喉镜叶片推开舌头及托起会厌软骨, 露出气管入口, 根据食蟹猴体型大小选择合适型号的气管插管(食蟹猴一般选用型号： 3.5#、4.0#、4.5#)进行插管，插管的顶端插到食蟹猴的肩部平行的位置, 插入之前大致对照下插入深度，插到位后, 充盈插管气囊, 用丝线类轻物放置在气管插管口，观察到丝线随呼吸气流摆动说明插管成功, 固定气管插管, 接通气管插管到呼吸机。

1.5.2 生命体征维持 打开氧气瓶开关及压力表开关，使压力表输出压力保持在0.2～0.4 MPa，打开呼吸机，调节潮气量大小10 mL/kg，呼吸频率25～30 次/ min，调节氧气流量计1 L/min(按照5 kg 食蟹猴)，接上心电图电极、血压袖带及血氧探头进行实时监测(图1)。先流通一段时间氧气，待血氧浓度正常，再打开异氟烷挥发罐开度至2%～2.5%，在手术过程中时时观察动物生命体征(心率、血压、血氧浓度、呼吸状态、瞳孔反应及对痛觉的反应)，避免麻醉过度。一般在手术后程挥发罐开度调至1%即可。

图 1 监护状态的食蟹猴

1.5.3 AMI 手术 辅助人员接通高频电刀，调节电刀功率电切(CUT)及电凝(COAG)功率15 W，在中单上倒入手术包、各型号线圈、一次性刀片、医用纱布叠片、医用棉签。手术操作者及辅助助手穿上手术服、帽子、口罩、灭菌橡胶外科手套，利用聚维酮碘及消毒酒精对左胸部区域交替消毒与脱碘处理，食蟹猴身上再铺1 层一次性中单，在手术部位把中单剪成圆形开口，露出手术部位，手术操作者于心脏体表左胸第4 肋处用电刀烧开皮肤层、肌肉层及肋骨肉层，露出心包，用扩胸器扩大所见心脏视野，用小剪刀小心剪开心包膜层，用帕巾钳把心包膜与肋骨肉层夹一起，用生理盐水浸湿的医用叠片垫在心脏四周, 找到左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery, LAD), 用医用棉签固定搏动中的心脏, 在第一对角支和第二对角支之间用5-0 prolene线缝针掌握好进针深度及进针宽度连续缝合2 针，待心动周期及心电周期正常后收线打结, 以达到梗死心尖前壁及心尖心肌。术中观察到心尖心肌变白及心电图ST 段抬高作为成功标志(图2、图3)。

结束后, 用医用纱布叠片吸净胸腔内血水渗出物，用医用棉签清理尽所有心脏部位纱布叠片，复原肺及心脏在胸腔的位置后，用2-0 或3-0 缝线分别对肋骨层、肌肉层、皮肤层逐层缝合，皮肤层用棱形缝合针，其他层用圆形缝合针。关肋骨层时用气囊膨肺，防止气胸出现。

1.5.4 关闭胸腔后处理 关掉麻醉药挥发罐开度,仍保持食蟹猴在插管状态下呼吸氧气，每只术后食蟹猴注射0.5 mL盐酸吗啡注射液。待食蟹猴完全清醒，生命体征(血压、心率、血氧浓度、呼吸)平稳后归笼，在笼中尽量侧卧并且脸向笼门便于观察。

图 2 结扎LAD 后的心脏

图 3 食蟹猴心梗前后Ⅱ导联心电对比图

2 护理

2.1 术中护理

AMI食蟹猴易发生室颤(ventricular fibrillation，VF)、心率失常及心脏骤停意外情况。电击除颤是VF治疗最有效的方法，随VF时间的延长除颤效果急剧下降[2]，叩击胸部，电极与皮肤间使用盐水纱布接触，要迅速准确地电击除颤，除颤仪能量调至7～10 J； 反复VF 除了电击除颤，还要合并使用肾上腺素、胺碘酮、利多卡因，小剂量开始给予，反复多次，逐渐加大剂量，直至心电恢复正常。心率失常处理： 盐酸利多卡因注射液, 局麻药, 常直接用在手术伤口, 主要浸润麻醉, 1.5 mg/kg 静脉治疗AMI 后室性早博和室性心动过速； 盐酸胺碘酮注射液，胺碘酮的药用作用能有效降低AMI 时伴有快速心率失常的发生率，可作为AMI时发生心率失常的首选药物，胺碘酮提高心室电稳定及异位搏动的作用, 能提高心肌的VF 阈值[3], 静脉给予最大用量不超过30 mg。心衰处理： 呋塞米注射液20 mg静脉给予强心利尿治疗, 合并使用浓度5% NaHCO3注射液一次性推入5 mL 防止因缺氧带来的酸中毒。心脏骤停处理：心肺复苏(CardioPulmonary Resuscitation，CPR)同时静脉给予0.25～0.5 mg 盐酸肾上腺素静脉给予。在CPR 过程中复苏效果不佳时，要拆线开胸直接按压心脏，尽可能不要放弃, 根据急救时间与急救效果判断有时要果断松开结扎点, 放弃造模, 以救活动物为主。在手术监护过程中经常测量食蟹猴血压和心率，当血压或心率持续下降时,要经静脉通道给予2～5 μg/mL 的肾上腺素滴注。

2.2 术后护理

2.2.1 食蟹猴的笼前观察 行为是食蟹猴喜怒哀乐的表达，只有通过日常细心观察才能掌握食蟹猴健康状况的第一手资料，如： 自我蜷缩，说明体虚畏寒；不敢对眼，害怕畏惧； 不能坐立或攀爬，匍匐笼中说明病痛不轻等等。而且，笼前观察是食蟹猴术后护理的关键步骤，如摄食量、大便和小便情况、底盘中是否发现拉稀便和呕吐物等，了解状况及需求才能对症护理，并记录下这些异常行为及时与兽医商量缓解办法，如是否继续给予盐酸吗啡用来减轻痛苦等。而且，建模后发生VF 时第一时间没有得到急救处理，会威胁食蟹猴的生命，前期努力工作成果也将失去，而且，缺少重要的数据资料也影响实验的进度及结果。一般在心肌梗死手术后3 d 内是食蟹猴转危为安的适应期，度过适应期后的康复一般不会有大的生命危险。

2.2.2 体温维持 由于麻醉药的作用，手术中食蟹猴的心率明显降低，机体处于放松状态，基础代谢处于低水平，从而导致食蟹猴低体温现象，而且，开胸手术及心肌梗死造成心脏正常的动力提供下降，造成心射血能力的不足使供血不足，双重作用使处于手术期的食蟹猴体温偏低。低体温会带来抗伤口感染力降低、苏醒延迟、机体缺氧导致酸中毒、也可能诱发低温式VF、胃肠功能减退等。术后经常可观察到食蟹猴脸色苍白、口腔黏膜色淡、身体紧缩，行动缓慢，表情空虚、呆滞及畏寒等表现，甚至出现低体温疾病反应。所以，术中及术后护理中必须保持食蟹猴体温的正常水平，如在术中利用温控手术台设置台面温度高出食蟹猴正常体温及手术台面用双层中单保温；术后食蟹猴单间饲养，饲养间温度适当高于其他饲养间(维持在25～28 ℃)，体虚的食蟹猴可以在金属铁丝笼上垫毛巾隔冷保温，也可在笼前放置取暖器增暖保温； 有时由于体虚原因可能出现呕吐、腹泻等症状，要及时清理干净口腔及呼吸道、肛门等处，保持干净清洁。

2.2.3 防止感染 术后前几日每日对外科手术伤口给予聚维酮碘清创, 术后前3 d每日2次(早、晚)80 万单位注射用青霉素钠肌肉内注射预防感染，伤口愈合不佳或伴随其他炎症症状时，可延长1～2 d 使用青霉素钠。对是否安装植入子或食蟹猴是否撕拉缝合线等情况，必要时还要穿上透气性好的防撕咬马甲以防护伤口被破坏，伤口愈合好后(一般术后7～10 d)表皮缝合线及时拆去，以伤口白净及干燥结痂为好，谨防红肿、开裂及皮肤深层脓肿的存在。发现食蟹猴手术伤口开裂，应及时缝合修复完整伤口开裂处。

2.2.4 必要的营养物质补充 术后营养补充是术后康复的根本。术后食蟹猴可以开始少量进食，循序渐进加大到日标准量，每日要记录进食量以便了解每只食蟹猴的每日饲料摄入量。在食蟹猴痛苦而不愿意饮食时，要多花心思满足它营养物质的摄入以维持机体基础代谢及康复的需要，这就要求管理工作人员细心观察记录食蟹猴的术后饮食情况。食蟹猴无进食欲望、饲料剩余量多、甚至水果也不吃的情况下，要丰富给食水果品种，要不怕麻烦少量多次给食。对完全不进食的食蟹猴要及时静脉滴注补充营养物质，或者经口腔灌胃补充营养物质，如牛奶、糖盐水等。

2.3 注意事项

使用盐酸氯胺酮后食蟹猴的唾液腺分泌明显,使用前10 min一般用抗胆碱药如硫酸阿托品注射液肌肉内注射，以减少腺体分泌，防止分泌物反流回肺, 降低麻醉风险。在实验过程中，如口腔出现大量唾液时, 应及时使用电动式吸引器吸尽。

心外科手术需要准备的物品较多，手术过程中出现意外情况也复杂，临时抢救处理需要物品较急，在手术前实验室管理工作人员要清点术中所需物品，并分类摆放，急救药品集中放置在专用框中，放置在救护人员可见范围之内。为方便急救给药，在输液器与留置针之间接上医用输液三通，在手术过程中除颤仪及电动吸引器随时处于待机状态。

手术完成后，食蟹猴不能行动前，不要拔掉气管插管，让食蟹猴多吸氧气；在归笼前，不要拔掉静脉留置针，防止发生VF、心率失常及猝死时急救给药需要。

3 结果

大动物基地在2014～2018年一共制作174例AMI 模型，其中3 例在AMI后出现心衰导致心脏骤停时，松开结扎点放弃继续实验； 4 例术中死亡； 14 例术后1 d 内死亡； 4 例术后2 d 内死亡；3例术后3 d 内死亡。

4 讨论

AMI 造模是研究心肌缺血损伤公认的模型。结扎法制作的动物模型AMI 范围较为清楚、确切、快速形成且易于复制，还可根据研究需要对心脏不同区域进行造模[4]。AMI 建模过程最为关键是开胸外科手术，胸外科手术操作要求手术人员与辅助人员之间密切配合，熟练造模技术人员能够根据要求控制AMI 范围的大小，还能够与麻醉人员互动配合掌握术中食蟹猴的实时状况及应对策略。

在AMI 的建模过程中，VF 是最常见的突发事件，VF 是最为危险的心率失常，电极除颤是最有效最直接的方法，及时发现VF、及时成功除颤是建模成功的另一关键因素。刘兴利[5]利用杂种犬对LAD 实施结扎，在30 min 内3/10 的结扎犬发生了VF，并认为AMI 时，缺血心肌与非缺血心肌电生理性质的改变是VF 形成的原因。有报道[6]，小型猪LAD 结扎位点过高是AMI后发生VF 的危险因素。有研究[7]表明，早期急性心肌缺血伴随大量的去甲肾上腺素(noradrenaline, NE)释放与积聚，局部缺血心肌在NE 的作用下表现为VF，而且，NE 的释放和积聚与在AMI后10～40 min 内成正向增加，随后递减。因此，在AMI早期阶段对VF 的及时发现，及合理应对与排除是建模成功不可忽视的因素。

动物存活状况除了与手术建模成功与否外，还与手术后的护理密切相关。建模动物由一个健康的个体，突然变成一个疾病模型，其中各种病态反应及各种相关的动物感受反应前后相差巨大,这就要求动物管理人员对建模后的动物进行各种有针对性看护与救助, AMI建模特别要注意每日的笼前观察, 并做好记录, 注意饮食情况、防受凉,防拉稀、防感染及必要的营养物质补充等。

该造模方法是在前降支第一对角支与第二对角支之间实施结扎，这是AMI造模常见的结扎位点。也有研究[8]认为结扎LAD 阻断血流75 %, 模型既可以真实反应冠状动脉疾病病变模式，而且能够保证AMI动物的存活率，能够有足够的模型动物供进一步的实验研究，模型动物是安全有效的。当然，也有模型动物回旋支及对角支供血丰富，能对前降支缺血区域及时补充血液，仅仅结扎LAD仍不能达到模型需求，可以对回旋支及对角支远端进行结扎，结扎时参考实时心电图及AMI 状态。

本文是近几年内食蟹猴AMI建模经验，可为相关科研人员提供参考。