基于纳米材料的适配体生物传感器在真菌毒素检测中的应用研究进展

田 静， 孙文怡， 黄宝玺， 郭志军

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600； 3.安图县市场监督管理局，吉林 安图 133600)

真菌毒素是真菌产生的具有毒性的次生代谢产物，常见的真菌毒素有黄曲霉毒素(aflatoxin, AF)，赭曲霉毒素(ochratoxin)，伏马菌素(Fumonisins, F)，串珠镰刀菌素(Moniliformin, MF)，玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)等[1-2]。真菌毒素通过被污染的谷物和饲料进入食物链，长期摄入会引起人类和动物的急性或慢性中毒，对人畜表现出致癌性和遗传毒性、致畸性、免疫抑制等[3-4]。近年来，由真菌毒素引起的食品安全问题在世界范围内日益突出，严重威胁人类健康和生命安全。

在食品中最为常见的是黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素(OTA)，现已被世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构(IARC)列为致癌污染物[5-6]。在大量关于真菌毒素爆发的报告中，最令人震惊的是2004年报告的肯尼亚125人因AFB1中毒导致死亡。考虑到真菌毒素的潜在威胁，有许多分析方法被开发用于测定各种基质中的真菌毒素，包括液相色谱(LC)，薄层色谱(TLC)，高效液相色谱(HPLC)，免疫亲和层析(IAC)，酶联免疫吸附测定(ELISA)和电化学免疫传感器等[7-10]。但是这些方法普遍具有一定的局限性，比如样品前处理复杂，检测周期长，成本高，需要大型仪器和专业的操作人员等[11]。如今，随着技术的发展和检测的需要已经出现了更多简单而经济的方法。

1 纳米材料

纳米材料(nanometermaterial)是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸(0.1～100 nm)或由它们作为基本单元构成的材料，在分析化学、材料化学、电化学和生物化学等领域都有着重要应用[12-13]。纳米材料具有独特的磁性、光学和导电特性等，可以提高检测的高灵敏度，降低检测限(LOD)[14]。因此，纳米材料被广泛应用于适配体生物传感器中，用作标记物或信号增强剂，具有增强信号和放大信号的作用[15]。常用纳米材料的优点见表1。

表1 不同纳米材料的优点

2 核酸适配体

核酸适配体(Aptamer)简称适配体，是通过指数富集(SELEX)进化技术从寡核苷酸序列库中筛选获得的对靶物质具有高亲和力的单链寡核苷酸片段[22]。与抗体一样，适配体与靶分子具有特异性识别结合的能力，因此被称为“化学抗体”。与抗体相比，适配体具有更多优点，如更小的尺寸，更好的组织穿透，更高的热稳定性，更低的免疫原性，更容易生产，更低的合成成本，易修饰等[23]。适配体作为一段寡核苷酸片段本身不具备信号转换功能，因此，目标分析物与适配体识别结合后，需通过换能器将识别信息转变成可定量处理的信号，最终检测出待测物浓度[24]。

3 适配体生物传感器及其在真菌毒素检测中的应用

生物传感器是指以生物分子(DNA，真菌毒素抗体，酶，微生物，细胞，组织等)为敏感元件，经分子识别后发生生物学反应，产生的信号被相应的物理或化学换能器转变成可定量处理的电化学、光学、电磁学等信号，再经2次放大输出，便可知道待测分析样品的浓度[25-26]。生物传感器检测原理示意图如图1所示。

Sample tobeanalysed-待测分析样品；Moleculary recognizing biomaterials-分子识别生物材料；Signal transducer-信号换能器；Detectable signal-检测信号。

图1 生物传感器的检测原理示意图

Fig.1 Schematic diagram of the detection principle of the biosensor

根据检测信号的不同，核酸适配体传感器主要分为比色适配体传感器、荧光适配体传感器、电化学适配体传感器、表面增强拉曼光谱适配体传感器等，本文基于纳米材料构建的适配体传感器为研究对象，通过不同的检测信号，对4种适配体传感器在真菌毒素检测方面的应用进行综述[27-28]。表2归纳了近5年基于纳米材料检测食品中真菌毒素的生物传感器的检测方法。

表2 食品中真菌毒素的生物传感器检测方法

3.1 基于纳米材料的比色信号适配体生物传感器在真菌毒素检测中的应用

比色信号检测是一种用肉眼就能看出颜色变化的分析方法，具有简单、快速、用肉眼就可以实现半定量检测的优点。目前，金银纳米材料是比色法最常用的显色纳米材料。曾宪冬等人[42]采用金纳米粒子作为比色探针，适配体为识别元件，建立了快速检测赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)的比色适配体传感器。首先，将作为连接链的OTA 适配体与其互补的DNA 链进行杂交，使功能化的金纳米粒子发生聚集。当溶液中加入OTA 时，OTA与适配体结合，从而使适配体链与互补的 DNA链发生解链，团聚的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中，颜色由蓝紫色变成红色。没有OTA加入时，颜色不变。栾云霞等[43]人使用纳米金在盐的诱导下凝聚后发生颜色变化，建立一种基于纳米金和单链DNA适配体检测AFB1的简单可行的检测方法。纳米金是一种胶体溶液，在高浓度 NaCl 的作用下凝聚产生颜色变化。当AFB1存在于溶液中时，适配体单链DNA特异性地与AFB1结合，形成特定的三维立体结构，该结构能抵抗纳米金的吸附。表面没有吸附单链DNA的纳米金在加入高浓度盐后凝聚, 溶液变为蓝色。当AFB1不存在于溶液中时，适配体暴露的正电荷与纳米金表面的负电荷发生静电作用而直接吸附到纳米金表面，吸附有单链适配体的纳米金在高盐浓度下保持分散，溶液颜色不变，仍为红色。因此，可利用分光光度计对溶液进行吸光度测定，即可建立吸光度与OTA浓度之间的线性关系，实现比色信号检测OTA。

3.2 基于纳米材料的荧光信号适配体生物传感器在真菌毒素检测中的应用

荧光信号检测法具有灵敏度高、检测限低、测定时间短等优点，因此基于荧光信号的适配体传感器受到广泛关注。Zhijun Guo等[44]人利用单壁碳纳米管(SWNTs)作为淬灭剂，构建了一种适用于OTA检测的荧光适配体传感器。其原理是在不存在靶分子(OTA)的情况下，适配体呈游离单链DNA状态，易被SWNTs吸附，适配体上标记的羧基荧光素(FAM)易被SWNTs通过能量共振转移而淬灭。在靶分子(OTA)存在情况下，适配体与OTA特异性识别结合，形成G-quadruplex二级结构， G-quadruplex结构能抵抗SWNTs的吸附，适配体上标记的荧光信号得以保留。因此，可以通过测定不同OTA浓度对应的荧光强度建立浓度与荧光强度的关系进行OTA检测，最终检测限为24.1 nM。Jing Zhang等[45]人报道了基于DNA支架和银纳米簇(DNA/AgNCs)作为信号平台的荧光适配体传感器，用于同时检测OTA和AFB1。将OTA适配体(Ap1)和AFB1适配体(Ap2)分别固定在磁珠MBs表面上再加入信号探针1(Sp1)和信号探针2(Sp2)进行杂交，形成Aps-Sps双链体结构。在存在这2种真菌毒素的情况下，它们与各自相应的Apt结合形成G-四链体的复合结构，Sp1和Sp2被释放。通过磁分离，上清液中的Sps作为相应的支架，与加入的AgNCs结合产生不同的荧光发射峰。随后，在DNA/AgNCs合成期间，向溶液中加入Zn(II)离子，使荧光强度增加更易于观察，其OTA和AFB1的线性范围为0.001～0.05 ng/mL，检测限OTA为0.2 pg/mL，AFB1为0.3 pg/mL。Zhisong Lu等[46]人开发了一种基于二硫化钼(MoS2)纳米片与半导体量子点(QDs)结合作为有效荧光淬灭剂(QDs-MoS2)和新型适配体-CDTe 用于检测OTA。当存在OTA时，适配体-QDs结构可以与OTA特异性结合形成折叠的四链体结构。并且OTA分子占据的核碱基被埋在结构内，适配体-QDs结构和MoS2纳米片之间的相互作用力变得非常弱，所以QDs荧光被保留。当不存在OTA时，适配体-QDs结构和MoS2纳米片相互作用，导致QDs荧光被MoS2纳米片淬灭。因此，通过荧光强度检测OTA的含量。该平台显示出良好的特异性，检测限为1.0 ng/mL。

3.3 基于纳米材料的电化学信号适配体生物传感器在真菌毒素检测中的应用

电化学信号检测方法具有选择性高、简便、成本低并且检测更加精密的优点。电化学适配体传感器是将靶分子与适配体特异性结合的识别信号转换为电化学信号，通过电流或电位的变化来检测目标分子，纳米材料的加入使其检测更加灵敏快速。Seyed Hamid Jalalian等[39]人基于金纳米颗粒(AuNPs)和黄曲霉毒素M1(AFM1)适配体(Apt)以及适配体互补链(CS)，构建了一种新型电化学适配体传感器用于AFM1的检测。Apt发夹结构在没有靶分子(AFM1)的情况下，CS修饰的AuNPs不会与金电极表面上的Apt结合，其原理是基于CS靶向诱导Apt和AuNPs的偶联。在AFM1存在的情况下，Apt发夹结构打开并形成Apt/AFM1复合结构。因此，Apt的5′端暴露出来与固定在AuNPs表面上的CS杂交。为了增加传感平台的灵敏度加入较少量的亚甲基蓝(加入的亚甲基蓝作为氧化还原剂导致带正电荷的亚甲基蓝与带负电荷的AuNPs和双链DNA之间发生静电相互作用)。在电极表面上富集的高浓度亚甲基蓝产生强电化学信号。另一方面，在没有AFM1的情况下，Apt会保留其发夹结构。因此，CS修饰的AuNPs不能与Apt结合，导致在电极表面上亚甲基蓝浓度较低，因此，只有微弱的电化学信号。该体系检测限为0.9 ng/L，并且成功应用于实际样品如牛奶和血清的检测。Rijian Mo等[47]人提出了一种基于氧化石墨烯(GO)修饰的聚丙烯酸(PAA)膜通过π-π堆积与AFB1的适配体结合用于检测AFB1的新型生物传感器。简而言之，通过共价键将适配体固定在PAA膜的纳米通道表面上，然后加入氧化石墨烯与适配体结合。通过引入带负电的氧化石墨烯和适配体，PAA纳米通道的负电荷增加，引起空间位阻。在添加AFB1时，AFB1与适配体特异性结合，氧化石墨烯从纳米通道的表面脱离，电荷密度和空间位阻减少，导致加入的Fe(CN)63-通过纳米通道的量增加，使电流响应增加。电流的增加与AFB1的浓度成正比，检测限约0.13 ng/mL，线性范围为1～20 ng/mL。此外，该传感器对AFB1具有良好的选择性。Yonghong Wang[38]开发了基于金纳米粒子和β-环糊精修饰的MoS2纳米片(MoS2-AuNPs-β-CD)的电化学适配体传感器用于OTA超灵敏检测。首先，通过β-环糊精(β-CD)主体-客体识别，在适配体末端用亚甲基蓝(MB)修饰过后固定在金电极的表面上，然后将MoS2纳米片/AuNPs纳米复合材料作为信号放大平台。当存在OTA时，MB-适配体的结构从垂直线性转变为G-四链体，其自身不能接近电极表面导致MB-适配体的氧化还原电流降低，而游离的二茂铁羧酸可识别并占据空位在电流中产生信号。在此基础上，对OTA进行了高灵敏度检测，OTA浓度对传感器信号的线性响应范围在0.1～50 nM，并且最低检测限为0.06 nM。该检测的方法易构建，具有高灵敏度和特异性。K. Yugender Goud等[36]人使用氧化石墨烯(GO)和亚甲基蓝(MB)氧化还原探针标记的适配体作为信号放大平台，开发出一种电化学适配体传感器，用于检测AFB1。将官能化的氧化石墨烯固定在碳电极(SPCE)上，然后使用六亚甲基二胺(HMDA)作为间隔物，通过碳二亚胺酰胺键将MB标记的适配体固定在SPCE上。当与目标靶分子AFB1相互作用时，适配体结构的双链体形式会转换为G-四链体形式，接近电极表面并进行快速电子转移。增加目标分析物的浓度四链体结构也会增加，随后，越来越多被MB标记的适配体更接近电极表面，导致电化学信号增加。在此设计中，氧化石墨烯层增加了传感器系统的导电和催化特性，有助于提高电化学信号对目标分析物识别的灵敏度。其AFB1的线性响应范围为0.05～6.0 ng/mL，检测限低至0.05 ng/mL，且显示出优良的选择特异性。

3.4 基于纳米材料的拉曼信号适配体生物传感器在真菌毒素检测中的应用

拉曼信号检测具有对样品无接触，无损伤、快速分析、灵敏度高的优点。拉曼信号适配体传感器是一种化学和生物检测的有效分析方法。Erdene-Ochir Ganbold等[48]人报道了一种基于银纳米颗粒(AgNPs)和Cy5染料标记的OTA适配体的表面增强拉曼散射(SERS)传感器测定OTA。当不存在OTA时，适配体可以容易地吸附在银纳米颗粒(AgNPs)的表面上并产生强的SERS信号。在0.1～10 nM浓度范围内加入OTA时，由于OTA与适配体结合，适配体不能吸附到AgNPs表面，因此SERS信号减少了40%。使用基于SERS的方法实现了OTA的纳摩尔检测。Mingxiu Yang等[49]人基于纳米晶体(GDADNTs)和氨基末端适配体缀合的磁珠(CS-Fe3O4)构建了一种新型的SERS适配体传感器，用于痕量检测AFB1。氨基末端适配体缀合的磁珠(CS-Fe3O4)和纳米晶体(GDADNTs)分别用作AFB1的捕获剂和传导剂。CS-Fe3O4作为捕获纳米探针，用于捕获靶标(AFB1)和富集SERS活性底物；GDADNTs作为报告纳米探针，用于增强和表达AFB1的拉曼信号。这样，报告探针和捕获探针将通过适配体的特异性连接形成检测平台，当AFB1存在时，GDADNTs与CS-Fe3O4和AFB1的适配体特异性结合，在磁分离后会显示明显的拉曼信号。当不存在AFB1时，GDADNTs不会与CS-Fe3O4聚集在一起，经过磁分离后，没有拉曼信号产生。Aike Li等[41]人首次制作了基于金纳米星(AuNS)与核-银纳米粒子(AgNP)的SERS传感器，用于检测AFB1。使用AFB1适配体(DNA1)修饰的AgNP粒子和互补序列(DNA2)修饰的AuNS粒子构建了SERS传感器。当AFB1适配体(DNA1)修饰的Ag粒子和互补序列(DNA2)修饰的Au粒子结合，SERS信号得到增强。当AFB1存在时，Ag粒子表面上的AFB1适配体将与靶标结合，Ag粒子被移除并且SERS信号减少。当AFB1不存在时，适配体无靶标结合，因此不会影响SERS信号。该SERS传感器对AFB1显示出极高的特异性，线性检测范围为1～1 000 pg/mL，检测限为0.48 pg/mL，使用花生奶的试验表明该传感器可用于实际样品检测。Quansheng Chen等[40]人基于Au和Ag核/壳纳米棒，将氨基末端AFB1适配体(NH2-DNA1)连接到磁珠(CS-Fe3O4)上作为富集纳米探针，巯基末端互补适配体(SH-DNA2)连接到AuNR @ DNTB @ Ag纳米棒(ADANRs)作为报告纳米探针，通过适配体和互补序列之间的杂交反应制备NH2-DNA1-CS-Fe3O4和SH-DNA2-ADANR来进行AFB1的检测。DNTB(二硫代二硝基苯甲酸)因其具有较大拉曼散射截面且无荧光干扰，作为拉曼报告分子嵌入Au和Ag核/壳纳米棒中。当存在AFB1时，AFB1将与NH2-DNA1-CS-Fe3O4竞争性结合，诱导SH-DNA2-ADANR与CS-Fe3O4的解离并进一步降低SERS信号。当不存在AFB1时，CS-Fe3O4与ADANRs表面修饰的NH2-DNA1与SH-DNA2结合形成复合物，即可收集到SERS信号。检测限为0.003 6 ng/mL。

以上4种适配体传感器应用相对广泛，一些其他传感器在检测真菌毒素方面报道相对较少，因为所需材料复杂，灵敏度较差，程序繁琐，成本较高等一系列因素限制了其检测体系的开发。纳米材料因具有良好的特性，被广泛应用于适配体生物传感器的开发，在检测真菌毒素方面具有良好的应用前景。

4 展望

真菌毒素极大威胁人类健康和生命安全，如今随着经济的发展，人们对食品安全更加重视。随着生物技术的不断发展，生物传感器成为一种高新技术在医学、军事、食品、农业等各个领域均得到了广泛的发展与应用，也为我们的生产生活带来了很大的方便。生物传感器的开发可以检测痕量的真菌毒素，并且具有耗时短、成本低、易操作等一系列优点，非常适用于食品安全紧急事件的现场快速检测和风险预警。但在真菌毒素的检测中也存在一些问题，如实际样品基质的复杂性，给检测的准确性带来一定难度；核酸适配体生物传感器中适配体筛选过程比较繁琐、没有针对任何靶标的统一筛选程序的标准，因此核酸适配体的稳定性还需进一步加强。在未来的发展中应优化生物传感器技术的检测性能，即优化它们的检测限、响应时间和特异性，致力于研发快速化、微型化、自动化的新型生物传感器。随着研究的深入，适配体与纳米材料的结合使得比色、荧光、电化学、拉曼等各类生物传感器的构建更加多元和便捷，因此，基于纳米材料的生物传感器的应用将变得更加广泛。相信随着分析方法及检测手段的进一步发展，生物传感器技术必将给人们的生活带来巨大的变化，并且在食品安全检测领域也将发挥越来越重要的作用。