基于ENO基因的猪附红细胞体病PCR-ELISA检测方法的建立

相思宇， 倪婷婷， 薛书江

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

猪附红细胞体病是由猪附红细胞体(Mycoplasmasuis)引起的一种以贫血、发热和黄疸为主要临床症状的传染病[1-2]。猪患病后可分为急性感染和慢性感染2种，该病具有较高的隐性感染率，常和其他疾病混合感染，使该病的临床诊断难度增加，给我国养殖业造成巨大经济损失[3-5]。因此，建立一种特异性高、灵敏度强的检测方法，对猪附红细胞体病的诊断和防治具有重要意义。

目前，猪附红细胞体病的诊断方法主要有直接镜检法(姬姆萨染色法，瑞氏染色法、丫啶橙染色法、电镜法)[6-8]、血清学诊断法(ELISA法)[8-10]、分子生物学诊断方法(DNA杂交技术法、PCR技术法、半套式PCR技术法)[11-12]和PCR-ELISA法[13-14]。其中，前3种方法虽然在附红细胞体病诊断方面得到了大量的应用，但3种方法均易出现假阳性和假阴性结果。而PCR-ELISA方法是一种将PCR扩增与ELISA检测相结合的技术，由Niemeyer等于1997年创建[15]。PCR-ELISA方法与前几种方法相比具有更高的敏感性和特异性，该技术不仅提高了检测结果的准确性和特异性，还有效避免了常规方法中容易错判的假阳性和假阴性结果。该方法已在病毒、微生物、寄生虫的检测以及肿瘤治疗等领域被普遍应用[15-17]。如2005年，Scotter等用实时荧光定量PCR法与PCR-ELISA法对侵入性曲霉感染的检测进行了比较，结果显示PCR-ELISA较实时荧光定量PCR具有更高的敏感性[18]。

虽然PCR-ELISA方法在寄生虫早期诊断方面得到了应用，但目前关于猪附红细胞体病的PCR-ELISA诊断方法较少。该试验根据GenBank上公布的猪附红细胞体ENO基因序列设计合成引物，旨在建立适用于猪附红细胞体病的诊断及流行病学调查的PCR-ELISA检测方法，从而为猪附红细胞体病的防治提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

猪血液样本采自吉林省延吉市某猪场。猪附红细胞体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫以及健康猪血清均由延边大学预防兽医实验室保存。DNA Marker、ExTaqDNA聚合酶、辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体、TMB显色液均购自大连宝生物工程有限公司；链霉亲和素、鲑鱼精DNA均购自上海生工生物股份有限公司；血液DNA提取试剂盒及质粒提取试剂盒均购自OMEGA生物公司。

1.2 PCR扩增以及PCR扩增条件的筛选

根据Genbank中猪附红细胞体 ENO基因(CP002525.1)，用Oligo6.0软件设计1对引物，并在上、下游引物的5′端分别标记生物素(BIOT)和地高辛(DIG)。(p1)：5′-BIOT-AGGGATACCGCATCAAGACAC-3′;(p2)：5′-DIG-TCATCGGAACCGACGTAAACT-3′。以猪附红细胞体阳性DNA为模板进行PCR扩增，25 μLPCR反应体系：模板DNA 2 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，ExTaqDNA 聚合酶 0.3 μL，上、下游引物各 1.5 μL，dd H2O 16.2 μL，dNTP 1 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，设置退火温度梯度从50～60 ℃：50.0 ℃、50.7 ℃、51.9 ℃、53.7 ℃、56.1 ℃、58.0 ℃、59.2 ℃和60.0 ℃，72 ℃ 45 s，共25个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带亮度选择最佳退火温度。以猪附红细胞体阳性DNA为模板，选择15、20、25、30、35个循环，同时选择10、30、50、100、300倍稀释PCR产物。测各孔OD630nm值，确定最佳循环数以及PCR产物稀释倍数。

1.3 PCR-ELISA检测步骤

将PBS用链霉亲和素稀释后，100 μL/孔，4 ℃条件下包被过夜。甩去液体并拍干，用200 μL/孔的PBST洗板，并拍干，重复3次后。加入封闭液200 μL/孔，封闭2 h，洗板拍干后加入PCR产物按1∶30稀释，100 μL/孔，37 ℃固定1 h。PBST洗板后拍干加入1∶2 000倍稀释的抗地高辛抗体,37 ℃作用1 h，洗板拍干后加入TMB显色液100 μL/孔，37 ℃避光放置10 min，用酶标仪测定OD630nm值。

1.4 ELISA反应条件的优化

在相同反应条件下，筛选链霉亲和素包被液(50 mmol/L pH值9.6碳酸盐缓冲液、40 mmol/L pH值6.8 Tris-HCL缓冲液以及40 mmol/L pH值8.8 Tris-HCL缓冲液)，选择碳酸盐缓冲溶液进行包被，对链霉亲和素包被浓度(10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL)和HRP标记的抗地高辛抗体稀释度(1∶1 000～1∶5 000)做方阵滴定。对封闭液鱼精DNA浓度(0.25、0.5、1.00、2.00 mg/mL)和封闭时间(30、60、120 min)进行筛选优化，根据以上优化的最佳条件。在37 ℃条件下，选择显色液作用10、15、20、25 min时测定各孔OD630nm值。

1.5 PCR-ELISA临界值的确定

1.6 PCR-ELISA的特异性试验

对猪附红细胞体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫及健康猪血的DNA，按所建立的PCR-ELISA方法进行检测，评价其特异性。

1.7 PCR-ELISA敏感性试验

将猪附红细胞体阳性DNA基因用去离子水进行梯度稀释，得到1.77×1011、1.77×1010、1.77×109、1.77×108、1.77×107、1.77×106和1.77×105拷贝/μL的一系列梯度浓度，按照最佳条件进行常规PCR及PCR-ELISA试验，比较二者敏感性并分析敏感性与DNA浓度的关系。

1.8 PCR-ELISA的重复性试验

选择同一批次包被的以及不同批次包被的酶标板，对4份猪附红细胞体PCR阳性产物进行批内以及批间重复性试验。每份样品重复5次测定OD630nm值，计算变异系数，以评估该方法的重复性。

1.9 临床样本检测

用本试验所建立的PCR-ELISA方法以及夏晓辉[16]建立的PCR-ELISA方法，对采自延吉市某猪场的40份猪血液样本进行检测，以比较二者的敏感性，并计算二者符合率。

1.10 数据分析

利用SPSS软件进行方差分析，检测差异显著性。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及其扩增条件的筛选结果

以猪附红细胞体阳性DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系与反应条件参照1.2步骤进行。结果得到大小约为170 bp的条带，与预期ENO基因片段大小相符(图1)。PCR扩增条件的筛选结果，58 ℃为最佳退火温度。PCR循环数和稀释倍数筛选结果显示，最佳循环数为25，PCR产物的最佳稀释倍数为1∶30。

注：M.DL 2 000vDNA Marker;1.ENO gene;2.Negative control

2.2 ELISA反应条件的优化

对ELISA反应条件的优化结果显示，最佳包被液为pH 9.6碳酸盐缓冲液；链酶亲和素最适浓度为5 μg/mL；抗地高辛抗体最佳稀释倍数为1∶2 000；鲑鱼精DNA最适浓度为1 mg/mL，封闭时间为37 ℃下反应2 h；最佳显色时间为15 min。

2.3 PCR-ELISA临界值的确定

在最佳条件下对30份猪附红细胞体阴性样本进行PCR-ELISA检测。根据SPSS软件计算得到平均值x=0.138，标准方差SD=0.018，由公式临界值=平均值+3×标准方差，求得阴性与阳性的判断标准OD630nm值为0.192。OD630nm≥0.192为阳性，反之则为阴性。

2.4 PCR-ELISA特异性试验

利用本试验建立的PCR-ELISA方法对猪附红细胞体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫及健康的猪血基因DNA进行检测，结果显示本试验所建立的方法仅对猪附红细胞体检测为阳性，对其他病原体表现为阴性(表1)，表明本试验具有良好的特异性。

表1 PCR-ELISA特异性试验

注：“+”为阳性；“-”为阴性。

2.5 PCR-ELISA敏感性检测

用本试验建立的PCR-ELISA对浓度分别为33、3.3、0.33 ng/μL和33、3.3、0.33 pg/μL及33 fg/μL的猪附红细胞体DNA进行检测。结果显示PCR-ELISA可检测出样本的最低浓度为0.33 pg/μL(表2)，而常规PCR检测方法可检测的模板最低浓度为3.3 pg/μL。表明该试验建立的PCR-ELISA的敏感性较高，且比常规PCR高约10倍。

表2 PCR-ELISA敏感性检测结果

2.6 PCR-ELISA重复性检测

批内重复性试验结果显示，5份样品的变异系数为2.59%～6.17%，5份样本变异系数均低于10%，说明建立的PCR-ELISA1检测方法的批内重复性良好(表3)。

表3 批内重复性试验(OD630nm)

批间重复性试验结果显示，5份样品的变异系数为3.45%～7.39%，变异系数均低于10%，说明建立的PCR-ELISA检测方法批间重复性良好(表4)。

表4 批间重复性试验(OD630nm)

2.7 临床样本检测

对40份血液样品应用本试验所建立的PCR-ELISA方法与夏晓辉建立的PCR-ELISA方法进行对比试验。结果显示，本试验所建立的PCR-ELISA检测出9份阳性样品，检出率为22.5%(9/40)，利用夏晓辉建立的PCR-ELISA方法检测出7份阳性样品，检出率为17.5%(7/40)，结果证明该试验建立的PCR-ELISA方法阳性检出率更高，二者的符合率为95%(表5)。

表5 临床样本检测结果

注：PCR-ELISA-1为夏晓辉建立的PCR-ELISA方法；PCR-ELISA-2为本试验建立的PCR-ELISA方法。

3 讨论与结论

猪附红细胞体病目前没有较稳定统一的诊断方法，因此，建立一种适合于临床准确诊断该病的检测方法，对该病的控制以及预防具有重要意义。国内外学者对猪附红细胞体的检测方法进行了大量研究。目前猪附红细胞体病的检测主要以传统检测方法为主，这些方法易产生假阳性和假阴性的结果，不适用于临床大批量检测猪附红细胞体病。Niemeyer等于1997年创建了PCR-ELISA技术，该方法具有所需试验仪器要求低、材料低廉、操作简便、特异性强、敏感性高、不易产生假阳性和假阴性等特点，适合大批量检测[13]。如2005年，Scotter等用实时荧光定量 PCR法与PCR-ELISA法对侵入性曲霉感染的检测进行了比较，结果显示PCR-ELISA较 实时荧光定量 PCR具有更高的敏感性[18]。PCR-ELISA 技术利用逐级放大生物信号，具有敏感、特异的优点。国内外研究表明，PCR-ELISA方法与传统方法相比较，敏感性提高了10～100倍[19]

2013年，夏晓辉等用猪附红细胞体OxaA基因成功建立了PCR-ELISA检测方法，结果显示建立的PCR-ELISA方法具有敏感、特异、安全和准确性高等特点[14]。而本试验则选择2011年GenBank上最新公布的ENO基因建立附红细胞体的PCR-ELISA检测方法。ENO作为发现的第3个猪附红细胞体的特异性基因，其表达蛋白是一种特异性更强的蛋白并具有很好的免疫原性，但目前还未建立该基因的PCR-ELISA诊断方法。因此，本试验选择该基因建立PCR-ELISA检测方法，对于猪附红细胞体的临床诊断具有重要意义。

本试验建立的PCR-ELISA方法与夏晓辉建立的PCR-ELISA方法相比较，优化了猪附红细胞体PCR-ELISA反应条件，简化了操作步骤，节省了操作时间，提高了检测的灵敏度。敏感性检测结果显示，本试验建立方法的检测浓度为1.77×106拷贝/μL的阳性DNA，与夏晓辉建立的方法检测最低浓度1.93×106拷贝/μL的阳性DNA比较，本试验建立的PCR-ELISA方法敏感性更高。对批内及批间的重复性进行检测，变异系数均低于10%，证明本试验建立的PCR-ELISA方法具有很好的稳定性。对40份临床血液进行PCR-ELISA检测，本试验方法阳性检出率为22.5%(9/40)，夏晓辉建立的PCR-ELISA方法阳性检出率为17.5%(7/40)，且二者的符合率为95%，由此证明，本试验建立的PCR-ELISA方法对临床样本检测的灵敏度更高。

此外，本试验建立PCR-ELISA方法的目的主要是在于通过对试验条件的筛选，建立一种敏感性更高，适合临床检测的试验方法。由于该方法是建立在PCR基础上，因此对PCR的循环数及PCR产物的浓度进行筛选至关重要[20]。试验结果证明，在25个循环时检测结果最好，扩增效率达到了峰值，25个循环后扩增效率进入平台期，因此确定25循环为最佳的循环数。而PCR产物的浓度则选择30倍稀释，原因在于30倍稀释时的OD值较对照组差异更加明显，并且高浓度的PCR产物有利于缩短固定时间。

本试验基于ENO基因所建立的猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法具有强的敏感性及特异性，易于临床应用。