水杨酸对东北刺人参黄酮和蒽醌积累的影响

田 文， 郝悦君， 孙浩丁， 安晓丽， 朴炫春， 廉美兰

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

东北刺人参(OplopanaxelatusNakai)又称刺参，五加科多年生落叶灌木，国家二级保护植物，全世界只有中国、俄罗斯和朝鲜3国境内有少量分布[1]。其干燥根和茎均可入药，是一种珍稀的药用植物，具有多种生物活性物质，主要有挥发油、黄酮类、蒽醌类、脂肪酸、多糖以及多种皂苷等[2]，常用来治疗神经衰弱、低血压和风湿性关节炎等症[3]。但是由于其人工栽培技术尚不成熟，无法满足市场需要，导致其野生资源遭到大量采伐，物种濒临灭绝。为改善东北刺人参资源现状，本实验室利用生物反应器实现了其不定根的培养[4-7]，但是由于一些条件因素尚未探明，导致培养的不定根有效物质含量较低，因此，仍需进一步研究以提高不定根有效物质含量。

黄酮类物质是植物的重要次生代谢产物之一，具有纯天然、高活性、见效快、作用广泛等特点，是极具开发前景的天然抗氧化剂，能有效减少和清除自由基，具有延缓人体衰老、防治疾病的作用[8-10]。蒽醌类物质常存在于植物的代谢产物中，具有止血、抗菌、泻下、利尿的作用[11-12]。研究表明，东北刺人参内含有多种黄酮类与蒽醌类物质[13]，因此，在利用生物反应器进行东北刺人参不定根培养时，为获得较高的黄酮类和蒽醌类物质，本研究以添加外源诱导子等方式，提高其积累量。

外源施加诱导子可以有效提高植物次生代谢产量[14]，其中SA是一种在植物组织培养中常用的诱导子[15]。目前研究表明，SA是一种重要的的内源信号分子，能够激活植物过敏反应和系统获得性抗性[16]。王博等[17]利用浓度为50～150 μmol/L的SA处理霍山石斛类原球茎，可显著促进多糖的合成，并且SA最佳处理浓度为100 μmol/L，培养18 d时，多糖产量提高了1.63倍；妮细炉等[18]用不同浓度SA处理鱼腥草幼苗，结果发现低浓度(50 μg/mL)的SA能增加鱼腥草幼苗的槲皮素。因此，试验利用SA处理东北刺人参不定根，探明SA处理浓度和处理时间对不定根中黄酮类和蒽醌类物质含量的影响，为东北刺人参不定根的资源利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

参照于丹等[7]的方法诱导和增殖培养东北刺人参不定根。将增殖培养的不定根切成约1 cm后，称取20 g接种于含有4 L培养基的5 L气球型气升式生物反应器中。培养基为MS+3 mg/L IBA+50 g/L糖，pH值为5.8，通气量75 mg/L，在温度为25 ℃条件下进行暗培养。将反应器培养30 d的不定根作为本研究的试验材料。

利用2种黄酮类物质的标准品和3种蒽醌类物质的标准品分别制成混合标准品用于HPLC测定。黄酮类和蒽醌类物质结构如图1。

图1 黄酮类物质及蒽醌类物质单体结构图

1.2 方法

1.2.1 SA处理浓度对东北刺人参不定根黄酮和蒽醌含量的影响

分别收集反应器内的不定根与培养基。在150 mL三角瓶中加入100 mL收集的培养基后，分别加入经滤膜(0.22 μm)过滤除菌的不同浓度的SA(0、90、100、110和120 μmol/L)。各诱导子处理的培养瓶中，接入12.5 g不定根后，将培养瓶置于120 r/min振荡器上(GTCS-2013B，金坛市科析仪器有限公司，中国)，在温度为25 ℃的黑暗条件下培养。8 d后利用高效液相色谱(HPLC)测定不定根中黄酮类(槲皮素、山奈素)和蒽醌类物质(芦荟大黄素、大黄酸和大黄素)含量。

1.2 2 SA处理时间对东北刺人参不定根黄酮和蒽醌含量的影响

分别收集反应器内的不定根与培养基。在150 mL三角瓶中加入100 mL收集的培养基后，加入经滤膜(0.22 μm)过滤除菌的100 μmol/L SA。诱导子处理的培养瓶中，接入12.5 g不定根后，将培养瓶放置于120 r/min的振荡器上，在温度为25 ℃的黑暗条件下分别培养6、7、8、9和10 d后收获不定根，并测定不定根中黄酮类和蒽醌类物质的含量。

1.2.3 测定方法

1.2.3.1 标准曲线的绘制

1) 黄酮类标准品溶液的配制：精确取1.4 mg槲皮素和0.6 mg山奈素标准品分别溶解于1 mL色谱甲醇中，待标准品完全溶解后各吸取0.5 mL置于5 mL容量瓶中，用色谱甲醇定容，配成浓度分别为0.14和0.06 mg/mL的标准品混合溶液。将1 mL黄酮类物质标准品储备液分别稀释5、10、20、50和100倍，进行HPLC检测。

2) 蒽醌类标准品溶液的配制：精确称取0.4 mg芦荟大黄素、0.3 mg大黄酸和0.6 mg大黄素标准品，分别溶解于1 mL甲醇和三氯甲烷以9∶1混合的溶液中,待完全溶解后各吸取0.5 mL于5 mL的容量瓶中，用色谱甲醇定容，配制浓度分别为0.04、0.03和0.06 mg/mL的混合溶液。将1 mL蒽醌类物质标准品储备液分别稀释5、10、20、50和100倍，进行HPLC检测。

1.2.3.2 黄酮类和蒽醌类物质含量的测定

参照杨浩[19]和Hossain等[20]的方法。将东北刺人参不定根研磨成粉末，并过80目筛，称取1 g粉末，置于250 mL蒸馏烧瓶中，加入50 mL 80%甲醇溶液(含5%盐酸)，80 ℃回流提取1 h，过滤后收集滤液，于60℃下减压浓缩，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相于60 ℃下减压挥干，甲醇定容至5 mL后，用0.45 μm滤膜过滤，既得待测样品。

1) 黄酮类物质测定条件：槲皮素和山荼素均采用366 nm波长下检测，进样量10 μL，流动相为甲醇与1%磷酸水溶液，流速0.8 mg/mL，柱温30 ℃。

2) 蒽醌类物质测定条件：芦荟大黄素、大黄酸及大黄素检测波长254 nm，流动相0.1% (v·v-1)的磷酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脱程序为：0～40 min，80% B,流速1.0 mg/L，柱温30 ℃。

1.3 数据分析及软件处理

所有试验重复3次，利用Graphpad prism 7软件程序，数据的对比分析使用邓肯氏新复极差法，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 SA浓度对东北刺人参黄酮和蒽醌类物质含量的影响

随着SA浓度的增加，不定根中槲皮素的含量呈先上升后下降的趋势，并且在100 μmol/L时，槲皮素含量达到最高，为121.57 μg/g(图2 A)。山奈素的含量变化趋势与槲皮素相同，也在100 μmol/L时达到最高，为110.27 μg/g(图2 B)。随着SA浓度的增加，芦荟大黄素、大黄酸和大黄素的含量也是先增加后减少，其中,在100 μmol/L时，3者含量最高，分别为56.04、302.86和97.55 μg/g(图3)。

图2 SA处理浓度对东北刺人参黄酮类物质含量的影响

图3 SA处理浓度对东北刺人参蒽醌类物质含量的影响

2.2 SA处理时间对东北刺人参黄酮和蒽醌类物质含量的影响

随着SA的处理时间增加，不定根中槲皮素、山萘素的含量先增加后减少，在处理8 d时，槲皮素和山奈素含量均达到最高值，分别为134.99和117.06 μg/g(图4)。不定根中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素的含量也是随着SA处理时间的增加呈先增加后减少的趋势，在处理8 d时，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素的含量达到最高值，分别为70.41、737.05和105.70 μg/g(图5)。

图4 SA处理时间对东北刺人参黄酮类物质含量的影响

图5 SA处理时间对东北刺人参蒽醌类物质含量的影响

3 讨论与结论

植物不定根培养技术作为一种植物次生代谢产物生产手段，具有生长周期短、可人为调控生长条件、重复性强等优点，目前已被广泛应用于濒危药用植物资源开发利用等领域[21]，东北刺人参作为一种珍稀药用植物，其不定根的生物反应器培养技术已经被相关领域学者报道[5]，该技术为解决东北刺人参资源紧缺的问题提供了方向，但是目前关于东北刺人参的黄酮类和蒽醌类物质生产的研究较少，生物反应器培养的不定根有效物质含量较低，导致生物反应器培养技术无法应用于东北刺人参产品的大规模生产，阻碍了其工业化应用。

SA在植物抵御和适应外界不良环境条件过程中发挥着重要作用，它能够改变相关防御基因的表达水平，使得某些次生代谢产物的累积水平发生改变。本研究在东北刺人参不定根培养30 d后，用不同浓度的水杨酸处理，并测定了不定根中黄酮类与蒽醌类物质的含量。结果表明，SA处理能够提高东北刺人参不定根中黄酮类物质的含量，当处理浓度在100 μmol/L时，生物反应器培养的东北刺人参不定根中黄酮类物质槲皮素与山奈素的含量达到最大值，分别为121.57和110.26 μg/g，分别是对照组的2.6与1.5倍；SA的处理时间为8 d时，不定根中黄酮类物质中槲皮素、山萘素的含量达到最高值，分别为134.99和117.06 μg/g，分别是对照组的2.0和1.7倍。谭玲玲等[18]用50 ug/mL SA处理后的鱼腥草槲皮素含量提高了近5倍，Wee等[22]研究发现,添加一定浓度SA后，体外培养的守宫木的代谢产物山奈素较对照组提高了10.2倍，这些研究结果与本次研究结果均表明，诱导子水杨酸能够提高体外培养植物组织内的黄酮类物质含量。

对于不定根中蒽醌类物质如芦荟大黄素、大黄酸和大黄素的含量，当SA处理浓度为100 μmol/L时，含量达到最高，分别为56.04、302.86和97.55 μg/g，分别是对照组的1.5、1.1和1.5倍。而对于处理时间的影响，当处理时间为8 d时，不定根中蒽醌类物质含量达到最高，分别为70.41、737.05和105.7 μg/g，且分别是对照组的2.0、2.9与2.1倍。Thiruvengadam等[23]的研究也表明，在进行何首乌体外细胞悬浮培养时，通过外源添加SA，能够使其中的蒽醌类物质如大黄素，大黄素甲醚等提高数倍，张志强等[24]的研究也证明SA能够提高海巴戟天悬浮细胞中的蒽醌类物质含量，且是对照组的1.18倍，这些研究与本次研究均表明，外源施加一定浓度SA处理一定的时间，能够促进离体培养组织中的蒽醌类物质的含量。

综上所述，适宜的水杨酸处理对东刺刺人参不定根有效物质合成具有促进作用，在培养第30天时，SA处理浓度为100 μmol/L并处理8 d，可有效提高东北刺人参不定根中黄酮和蒽醌类物质的含量。