酪酸梭菌二联活菌对晚期早产儿外周血T细胞表达CD28和PD-1的影响及临床意义

郑雨微，唐宗生，陶雨琦，方 玢，张士发*

(1.皖南医学院弋矶山医院 儿科，安徽 芜湖241001；2.皖南医学院弋矶山医院 输血科，安徽 芜湖241001)

晚期早产儿是指孕周为340/7～366/7的早产儿，占早产儿的大部分。与足月儿相比，晚期早产儿免疫系统功能尚不完善，黄疸、喂养困难、呼吸系统疾病的发生率明显升高，肠道定植菌也有所不同[1]。益生菌制剂的应用，可以有效的改善晚期早产儿早期肠道定植菌，促进肠道功能的稳定。目前发现，早期定植菌种类与成长过程中一些疾病发生如哮喘、急性胃肠道炎、腹泻、肥胖等有一定关系[2,3]。虽然目前有较多关于新生儿使用益生菌调节剂后免疫系统改变的研究，但是具体的机制尚不清楚。PD-1作为一种免疫抑制信号分子，可以有效调节体内免疫应答反应。有研究表明，改变肠道菌群后，可以改善PD-1抑制剂疗效，减轻病人的症状[4]。在使用PD-1抑制剂治疗癌症时，增殖的主要是CD28+CD8+T细胞[5]。CD28是一种免疫刺激性分子，主要刺激T细胞活化、增值、分化。所以我们设计了这个实验，观察晚期早产儿使用益生菌制剂—酪酸梭菌二联活菌前后，T细胞表面PD-1和CD28表达变化，从而进一步探讨益生菌调节晚期早产儿免疫系统的机制，为临床运用益生菌制剂治疗晚期早产儿提供一定的研究基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象及纳排标准

选取皖南医学院弋矶山医院2015.06至2017.01收治入新生儿重症监护室的晚期早产儿(34周≤孕周<37)40人，按随机分组法均分为对照组和实验组，每组20人。最终有35例完成实验(对照组18例，实验组17例)，5例退出实验(提前出院2例，实验期间服用抗生素2例，标本量过少1例)。实验组：将酪酸梭菌二联活菌210 mg(科兴生物公司提供，420 mg药粉/粒，有效期内含酪酸梭菌活菌不低于1.0×10^7cFu/g，含双歧杆菌活菌粉不低于1.0×10^6cFu/g)溶于奶粉溶液，给患儿口服，一日两次；对照组：服用相同剂量的奶粉溶液。持续7天。实验和对照组在出生体重、性别、年龄、分娩方式方面无统计学差异(P>0.05)。此次研究纳入标准：母孕期无感染、胎膜早破、免疫疾病，晚期早产儿无窒息、宫内感染、服用抗生素。实验经医院伦理委员会批准，并获得患者家属知情同意。

1.2 实验主要试剂与仪器

Anti-Human CD3-ECD(美国Beckman公司)、Anti-Human CD4-PC5 (美国eBioscience公司)、Anti-Human CD8-PC7 (美国Beckman公司)、Anti-Human PD-1-FITC和Isotype抗体(美国Biolegend公司)、Anti-Human CD28-PE和Isotype抗体 (美国eBioscience公司)、人淋巴细胞细胞分离液(天津灏洋生物制品公司)、PBS缓冲液 (北京Thermo公司)、FC500 MPL流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.3 标本采集与检测

1.3.1标本采集 分别在入院24 h内及干预7天后，抽取患儿外周静脉血1 ml，EDTA抗凝管保存待检。

1.3.2PBMC分离 将1 ml标本用0.9%氯化钠溶液稀释一倍，再用1 ml加样枪缓慢叠加到有3 ml淋巴细胞分离液的15 ml离心管中，2 000 rpm×20 min离心；小心抽吸离心后中间的白膜层，置于15 ml离心管中；再于离心管中加入8 ml 1640细胞培养液，2 000 rpm×10 min离心；弃上清，加PBS至10 ml刻度，再次2 000 rpm×10 min离心：弃上清，加入1 ml PBS，涡旋，配成细胞悬液。

1.3.3流式检测 取2只流式管标号为1、2，1号管中依次加入3 μl荧光标记抗体CD3 -ECD、CD4-PC5、CD8-PC7、PD-1-FITC、CD28-PE,2号管加入CD3-ECD、CD4-PC5、CD8-PC7、PD-1 Isotype、CD28 Isotype各3 μl；每管加入再悬好的淋巴细胞200 μl，震荡，室温避光孵育30 min；1500 rpm×5 min离心，弃上清；加入500 μl PBS，震荡，流式细胞仪检测。

1.3.4生化检查 入院24 h内抽取患儿外周静脉血2 ml，送检验科进行生化检查：白蛋白、球蛋白、总蛋白含量。

1.4 统计学分析

流式实验结果使用Flowjo(7.6)软件分析。CD4+与CD8+T细胞上PD-1和CD28表达采用平均荧光强度(MFI)表示。所得数据采用Graphpad prism(6.0)软件分析。 Wilcoxon 配对检验比较组内干预前后的差异；MannWhitney U 检验用于比较不同两组间的区别；Spearman检验用于相关性分析。以α<0.05为检验水准。

2 结果

2.1 酪酸梭菌二联活菌治疗对晚期早产儿外周血CD8+T细胞表达PD-1和CD28的影响

图1A表示CD8+T细胞表面表达的PD-1及Isotype的流式散点图；相对对照组，实验组在干预后，CD8+T细胞上PD-1表达更高 (P=0.0262)，见图1B，但CD28无明显改变(P=0.2619)，见图1C。

图1 CD8+ T细胞表面PD-1和CD28表达状况

2.2 酪酸梭菌二联活菌治疗对晚期早产儿外周血CD4+T细胞表达PD-1和CD28的影响

流式直方图表示实验组干预前后PD-1(见图2A)和CD28(见图2B)在CD4+ T细胞表面表达状况；相对于对照组，实验组在干预前后，其CD4+T 细胞PD-1的表达的下降幅度(治疗后与治疗前的比值)和CD28的表达的上升幅度均显著增高 (P=0.0318；P=0.0038)，分别见图2C、 2D。

图2 CD4+ T细胞表面PD-1和CD28表达的变化幅度

2.3 晚期早产儿外周血CD8+T 细胞PD-1和CD28表达与临床指标相关性

干预前，所有晚期早产儿(对照组和实验组)CD8+T细胞 PD-1表达的MFI与其血清白蛋白呈负相关 (r=-0.5097，P=0.0018)，见图3A；干预前，所有晚期早产儿CD8+T 细胞CD28表达的MFI与其血清球蛋白成正相关 (r=0.5699，P=0.0004)，见图3B。

图3 PD-1、CD28与临床指标的相关性

3 讨论

早产儿早期肠道微生物的定植有利于维护肠道粘膜屏障功能的稳定，可产生抗病原微生物物质，减少肠道致病菌的感染。当肠道菌群失调时可以导致如腹泻、营养不良，甚至可能与后期哮喘、炎症性肠病有关[6]。益生菌是对人体有益的微生物，常用于肠道功能紊乱疾病的治疗[7]，与人体免疫系统的功能有一定关系。一个稳定的免疫系统对机体健康有很大影响，当机体免疫功能低下时，容易发生感染性疾病；而当免疫功能过强时，自身免疫病的发生率又会有所提高。T细胞主要与机体的细胞免疫相关，其活化时不仅需要抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)提供主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)为第一活化信号，同时还需要协同刺激信号分子的激活提供的第二活化信号。其中PD-1就是一种抑制性信号分子，可以抑制T细胞的活化。PD-1不仅仅在T细胞表面表达，在B细胞、骨髓细胞等都有所表达，在免疫调节过程中发挥非常广泛作用。CD28则是一种刺激性信号分子，在95% CD4+T细胞和50% CD8+T细胞上表达，可以降低T细胞活化阈值[8]。

有研究发现在慢性感染、肿瘤患者体内PD-1及其配体持续高表达，使T细胞功能耗竭，当使用阻断PD-1信号通路药物时，可以显著的减轻患者的症状[9]，说明PD-1高表达对T细胞活化有抑制作用，从而影响了机体的免疫应答。Routy[4]等人进一步报道，原本对PD-1通路抑制剂效果不佳的肿瘤患者在口服益生菌之后，临床症状明显改善。益生菌可能通过调节其肠道微生物构成，抑制了PD-1信号通路，最终调控机体免疫应答反应。在Kamphorst Alice O的研究中也发现，基因工程技术敲除CD28基因或使用抗体阻断CD28表达的小鼠，T细胞不能对PD-1抑制剂产生有效反应实现增殖[5]，说明CD28对PD-1信号通路发挥作用也存在一定影响。本研究发现，相对于对照组，口服酪酸梭菌二联活菌可以使晚期早产儿外周血CD8+T细胞上PD-1表达升高，而CD28表达没有显著变化。这个结果表明：口服酪酸梭菌二联活菌能够有效抑制晚期早产儿外周循环血CD8+T细胞的活化。同时我们发现，相对于对照组，实验组CD4+T 细胞PD-1的表达的下降幅度(治疗后与治疗前的比值)和CD28的表达的上升幅度更大。因此我们认为，相对于单纯的奶粉溶液，口服酪酸梭菌二联活菌能够有效加快晚期早产儿外周循环血CD4+T细胞的活化速度。益生菌作为一种外来微生物，可以刺激机体产生免疫应答，研究表明服用益生菌可以促进CD4+T细胞活化，充分发挥机体免疫功能[10,11]。所以我们推测酪酸梭菌二联活菌可能通过调节CD28 和PD-1分别在CD4+T细胞的高、低表达，及PD-1在CD8+T细胞的高表达，最终影响和调节晚期早产儿免疫功能。此结果表明：相对于CD8+T细胞，酪酸梭菌二联活菌治疗更有益于促进CD4+T细胞的活化；CD8+T细胞受到PD-1调控，而不至于活化过度。CD8+T主要是细胞毒性T淋巴细胞，是细胞免疫的主要细胞，具有细胞毒作用，可以特异性杀伤靶细胞[12]。这也与我们之前口服益生菌对抑制性分子B、T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)影响的研究结果一致，口服益生菌后，可以促进BTLA在CD8+ T细胞上的表达，从而抑制CD8+T细胞的过度活化[13]。

白蛋白是人体内数量最多的蛋白质，蛋白分子量较小，所以在体内主要起运输和维持血浆渗透压的作用[14]，在临床中也可应用于疾病治疗的疗效评价，如川崎病、格林-巴利综合征免疫球蛋白治疗效果[15,16]。有研究表明，对于自身免疫性脑炎患者，白蛋白低的患者免疫抑制治疗效果相对而言不佳，没有白蛋白高患者对治疗敏感性高[17]。晚期早产儿的免疫系统尚未成熟，更容易导致各种病原体的感染，当白蛋白水平较高时，其感染的概率低，同时预后也更加良好[18]。我们发现，所有患儿在治疗前CD8+T细胞PD-1表达与白蛋白表达是一种负性关系(r= -0.502，P=0.0147)，CD28与球蛋白表达是一种正性相关(r=0.5699，P=0.0004) 的关系。说明CD8+T细胞PD-1和CD28均是判断晚期早产儿的免疫功能的敏感指标。其临床意义有待进一步的深入研究。此外，当CD28与B7结合后，可以促进CD40L的表达，使B细胞增殖分化，调节免疫球蛋白的类型转换，同时使B细胞对Fasl介导的凋亡易感性减低，与B细胞抗体的形成有一定关系。球蛋白是人体内的各种抗体总和，具有免疫作用，可以抵抗病原体感染，减少疾病的发生。这给我们提供一些参考作用，当PD-1表达升高、CD28表达降低时，要注意提防晚期早产儿可能发生感染性疾病。

当然本研究还有一些不足之处，由于晚期早产儿抽血困难，配合度不是特别高，也导致了我们样本量可能不能完全满足要求。

综上所述，我们认为益生菌可能通过影响T细胞上CD28，PD-1分子表达来调节免疫系统功能，在促进T细胞活化的同时，也会防止T细胞的过度活化。白蛋白和球蛋白与免疫细胞的活化程度存在一定的相关性。总之，将T细胞表面的信号分子的表达状况与临床常用指标进行综合研究，可为我们将来在科研实践、评价患者疗效及预后方面提供一定的参考。