大孔树脂纯化龙眼核多酚及其组分分析

何 婷,王 凯,赵 雷,胡卓炎

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

龙眼(DimocarpuslonganLour.)又称桂圆,属无患子科[1]。现代研究表明龙眼果肉具有抗衰老、降血脂、免疫调节等作用[2],而且其种仁龙眼核也具有显著的医疗保健作用[3]。龙眼核约占龙眼果重的17%[4],含有大量的多酚、黄酮等活性物质[5-6]。据相关研究报道,多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血脂等生理功能[7],被广泛应用于食品、医药、保健营养等众多领域[8]。而在龙眼加工过程中,每年废弃的龙眼核多达十几万吨[9],造成严重的资源浪费。

目前国内外对龙眼核的研究主要集中在淀粉[10]、色素[11]、总黄酮[12]及多酚[13]的提取、利用树脂初步吸附分离纯化多酚[14-15]、粗提液的降血糖作用[16-17]。但目前,龙眼核多酚类物质的组成成分尚不明确,缺乏系统研究。

本研究以‘储良’品种的龙眼核为原料,采用乙醇提取其中的多酚类物质并用大孔树脂对其纯化,对比四种大孔树脂的纯化效果,并对纯化条件进行优化。运用高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOP-MS/MS)对龙眼核多酚提取物的主要组成成分进行分析和鉴定,旨在为龙眼核多酚的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

储良龙眼 广东省茂名高州市;大孔树脂D101、D3520、AB-8、DM21 南开大学化工厂;95%乙醇 分析纯,天津富宇精细化工有限公司;福林酚、没食子酸 分析纯,上海源叶生物科技有限公司;盐酸、氢氧化钠 分析纯,天津大茂化学试剂厂。

BJ-150型多功能粉碎机 德清拜杰电器有限公司;AUW120型电子分析天平、Uvmini-1240型紫外分光光度计 日本岛津公司;SHA-CA晶波水浴恒温振荡 常州普天仪器制造有限公司;YZ1515型恒流泵 保定齐力恒流泵有限公司;6540UHD-Q-TOF型质谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 龙眼核多酚的提取 新鲜龙眼采收后当天运回实验室,人工去皮取肉,果核经清洗干净,置于60 ℃烘箱中烘干至恒重,用多功能粉碎机粉碎成粉末过60目筛备用。准确称取龙眼核粉末100 g,加入3 L 95%乙醇后,在70 ℃下用搅拌机搅拌90 min,提取3次。合并提取液,2150×g离心10 min,50 ℃下减压浓缩至一定浓度后置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 龙眼核总酚含量的测定 参考Nuchanart等[18]的方法测定龙眼核中多酚含量。浓缩后的样品溶液用70%乙醇稀释,取0.1 mL稀释后的样品溶液加入0.5 mL福林酚溶液,混匀后于室温下反应3～4 min。在8 min内加入1.5 mL 20%碳酸钠溶液后定容至10 mL。室温下反应2 h后,用分光光度计在765 nm波长处测定标准溶液的吸光度。以没食子酸做标准品得到标准曲线为:Y=0.0586X+0.007,R2=0.9993。标准曲线的拟合度良好,可以用于测定龙眼核多酚含量。

1.2.3 龙眼核多酚的纯化

1.2.3.1 大孔树脂的吸附量、吸附率及解吸量、解吸率的测定 将大孔树脂分别于95%乙醇中浸泡24 h,用蒸馏水洗至无醇味,再用体积分数5%的NaOH溶液浸泡12 h,洗涤至中性后浸泡于体积分数5%的HCl中12 h,洗涤至中性后静置待用[19]。

准确称取经过预处理的AB-8、D3520、D101、DM21四种树脂(滤纸吸干)各5.0 g于锥形瓶中,加入50 mL龙眼核多酚粗提液(多酚质量浓度为2.6 mg/mL),置于30 ℃、120 r/min摇床上恒温振荡24 h后测上清液中的多酚浓度,分别计算得到四种大孔树脂的吸附量和吸附率。将吸附饱和的树脂加入50 mL、95%乙醇中,在上述条件下解吸24 h后测多酚的含量[20]。

根据公式(1)～(4)计算不同树脂的吸附量、吸附率、解吸量和解吸率。

吸附量(mg/g湿树脂)=(C0-Ce)×V0/W

式(1)

吸附率(%)=(C0-Ce)/C0×100

式(2)

解吸量(mg/g湿树脂)=Cd×Vd/W

式(3)

解吸率(%)=Cd/(C0-Ce)×100

式(4)

式中:C0为未吸附初始多酚浓度(mg/mL);Cd为解吸液的多酚浓度(mg/mL);Ce为吸附平衡时多酚浓度(mg/mL);V0为多酚初始加入体积(mL);Vd为解吸液体积(mL);W为湿树脂质量(g)。

1.2.3.2 大孔树脂的静态吸附及解吸动力学 将大孔树脂按1.2.3.1所述方法预处理后,称取10份5.0 g(滤纸吸干)大孔树脂,与50 mL的龙眼核多酚粗提液混合,置于摇床上于30 ℃、120 r/min分别振荡1、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h后取1 mL上清液,按式(2)计算大孔树脂的吸附率,每个时间点做两个平行,取平均值绘制静态吸附曲线。称取10份吸附饱和的树脂加入50 mL、95%的乙醇在同样的条件于1、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h时分别取解吸上清液1 mL,按式(4)计算大孔树脂的解吸率,每个时间点做两个平行,取平均值绘制静态解吸曲线[21-22]。

1.2.3.3 乙醇浓度对AB-8大孔树脂静态解吸效果的影响 取按1.2.3.1所述处理的7份吸附饱和的AB-8树脂,分别置于锥形瓶中,各加入50 mL不同浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%)的乙醇溶液,置于摇床上(30 ℃、120 r/min)振荡解吸10 h,收集不同乙醇浓度的解吸液,测定多酚的浓度,计算解吸率,实验重复两次。

1.2.3.4 洗脱液pH对AB-8大孔树脂静态解吸效果的影响 取按1.2.3.1所述处理的6份吸附饱和的AB-8树脂,分别置于锥形瓶中,各加入50 mL浓度为70%乙醇溶液,用0.1 mol/L的NaOH和HCl溶液调节至不同pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5),置于摇床上(30 ℃、120 r/min)振荡解吸10 h,收集不同pH的解吸液,测定多酚的浓度,计算解吸率,实验重复两次。

1.2.3.5 龙眼核多酚动态洗脱曲线 将活化后的AB-8树脂湿法装入玻璃层析柱(2.5 cm×60 cm)中,待树脂柱平衡后,加入龙眼核多酚粗提液。用蒸馏水洗脱杂质,以pH为4、浓度为70%的乙醇进行动态洗脱,分管收集洗脱液(10 mL/管),测定每管洗脱液中的多酚浓度。

1.2.4 LC-MS分析龙眼核多酚的组成成分 参考Li等[23]、Chen等[24]的方法,采用LC-MS对龙眼核多酚的组成成分进行测定。色谱条件:安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱,紫外分光光度检测器,柱温30 ℃,流速1.0 mL/min,检测波长280 nm。无机相为0.4%(v/v)甲酸水溶液,有机相为乙腈。梯度洗脱:0～20 min(乙腈25%～35%),20～40 min(乙腈35%～55%),40～50 min(乙腈55%),55 min(乙腈25%)。

质谱条件:ESI离子源,负离子模式全扫描检测,扫描范围50～1000 m/z,干燥气为氮气。

1.3 数据处理

树脂筛选、吸附解吸动力学曲线及乙醇浓度和pH对大孔树脂解吸效果的影响采用SPSS 16.0对数据进行显著性分析(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

四种大孔树脂(AB-8、D3520、D101和DM21)的静态吸附量、吸附率、解吸量和解吸率如表1所示。从表中可以得出,AB-8和D101的吸附量(13.40、13.18 mg)和吸附率(51.36%、50.49%)均显著(p<0.05)高于D3520和DM21的吸附量(11.63、11.36 mg)和吸附率(44.57%、43.54%),说明AB-8和D101对龙眼核多酚的吸附效果较好。AB-8和D101的解吸量(12.92、12.82 mg)显著(p<0.05)高于D3520(11.59 mg)和DM21(10.98 mg),但二者的解吸率处于D3520(99.36%)和DM21(96.59%)之间。综合考虑吸附率、解吸率、解吸率、解吸量,认为AB-8和D101的静态吸附和解吸效果较好,因此选择AB-8和D101树脂作进一步研究。

表1 4种大孔树脂的静态吸附和解吸性能

2.2 大孔树脂AB-8和D101的静态吸附和解吸动力学曲线

从图1a可以得出,两种树脂都能在短时间内吸附较多的龙眼核多酚。随着吸附时间的延长,吸附速率逐渐上升,但升高程度逐渐变慢,AB-8和D101分别在5和6 h后趋于吸附平衡。两种树脂对龙眼核多酚的吸附能力略有差异,AB-8树脂较D101树脂的吸附率更高。从图1b可以得出随着解吸时间的延长,两种树脂的解吸率逐渐上升,解吸10 h后基本达到平衡,AB-8的解吸率略高于D101。因此,AB-8树脂在龙眼核多酚吸附和解吸特性上优于D101树脂,故选择AB-8树脂对其纯化龙眼核多酚的条件进一步优化。

图1 静态吸附(a)与解吸(b)动力学曲线

2.3 乙醇浓度对AB-8树脂解吸效果的影响

多酚类物质一般具有一定的极性和亲水性,所以具有一定的极性的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等极性溶液对多酚的解吸具有良好的效果[25-26],但是考虑到安全无毒性和廉价易得,选择乙醇作为洗脱剂。不同浓度的乙醇对AB-8树脂静态解吸效果如图2所示。随着乙醇浓度的增加,解吸率先升高后下降,当乙醇浓度为70%时,解吸率最高达到99.03%。根据“相似相溶”原理,龙眼核乙醇提取物中多酚极性较大,低浓度的乙醇不能破坏树脂与多酚形成的氢键,故解吸率较低。而高浓度乙醇会使极性与多酚极性相差变大[27],解吸率亦会降低。因此,选择浓度为70%乙醇作为龙眼核多酚的洗脱剂。

图2 乙醇浓度对AB-8树脂解吸率的影响

2.4 解吸液pH对AB-8树脂解吸效果的影响

由图3可知,当解吸液的pH由2升高至4时,AB-8树脂的解吸率由91.36%逐渐升高至99.82%。而当解吸液的pH进一步升高至4.5时,AB-8树脂的解吸率显著降低至96.10%。说明解吸液pH为4时最适合大孔树脂AB-8解吸龙眼核多酚。这是因为从龙眼核中提取出的多酚物质含有较多酚羟基结构,呈弱酸性,不稳定[21]。在弱酸性条件下能保持分子状态从大孔树脂上解吸,当pH过低,多酚在水中溶解度降低,不利于解吸;而pH过高时,不利于保持酚羟基结构。

图3 解吸液pH对AB-8树脂解吸率的影响

2.5 洗脱液体积对龙眼核多酚洗脱效果的影响

龙眼核多酚动态洗脱曲线如图4,当洗脱液体积为50 mL时,龙眼核多酚有少量被洗脱出来。随后龙眼核多酚随着洗脱液的增加而急速被洗脱出来且在90 mL时浓度达到最大值6.48 mg/mL。在250 mL时基本将龙眼核多酚洗脱出来。因此考虑洗脱效率,用250 mL的洗脱液进行洗脱。从图4中看出动态条件下AB-8树脂上吸附的龙眼核多酚易被洗脱下来,龙眼核多酚洗脱峰比较集中,峰型基本对称。

图4 洗脱液体积对龙眼核多酚洗脱效果的影响

2.6 龙眼核多酚的组成分析

龙眼核多酚在负离子模式下的总离子流图如图5所示。从图中可以看出,龙眼核提取物中多酚类物质能够得到较好的分离,得到13个响应较好的色谱峰。对各成分进行一、二级质谱分析,结果见图6。将龙眼核多酚主要成分的保留时间,一、二级质谱分子离子峰和相对分子质量归纳总结于表2。结合数据库和相关文献进行分析,推测各成分的化学名称见表2和分子结构见图6。

表2 龙眼核多酚化合物的质谱数据

图5 负离子模式下龙眼核乙醇提取物的总离子流图

图6 龙眼核多酚的二级质谱和结构图

峰1产生m/z 483.0786的分子离子峰,即[M-H]-为483.0786,分子量为484。在MS2中产生碎片m/z 169.0147,如图6a所示为没食子酸的分子离子峰,结合数据库分析确定峰成分1为1,2′-双-O-没食子酰-D-呋喃金缕梅糖(1,2′-Di-O-galloylhamamelofuranose)。峰2给出准分子离子m/z为633.0738[M-H]-,碎片离子m/z 463.0521为[M-没食子酸]-,m/z 300.9994和m/z 169.0139分别为鞣花酸和没食子酸的分子离子峰,子离子碎片(图6b)与文献[28-29]报道一致,确定峰成分2为柯里拉京(Corilagin)。峰3的m/z为289.0720[M-H]-,在MS2中产生的碎片离子m/z 247.0250,如图6c所示,是准分子离子[M-H]-失去一个中性碎片CO2得到,结合数据库分析确定峰成分3为6-Hydroxy-alpha-pyrufuran。峰4的m/z为469.0029[M-H]-,m/z 425.0157为[M-H-CO2]-,m/z 299.9911[M-H]-是准分子离子[M-H]-失去一分子没食子酸所得,二级碎片离子(图6d)与文献[30]报道一致,故判断峰成分4为地榆酸内酯(Sanguisorbic acid dilactone)。峰5产生 m/z为953.0904[M-H]-的分子离子峰(图6e),与文献[30-34]报道的二级离子碎片一致,确定峰成分5为诃子鞣质(Chebulagic acid)。峰6给出准分子离子m/z为197.0454[M-H]-(图6f),是没食子酸的衍生物[35],结合数据库分析峰成分6为3,4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸(3,4-O-Dimethylgallic acid)。峰7产生m/z为461.1682[M-H]-的分子离子峰,在MS2中产生的碎片m/z 300.9992(图6g)为鞣花酸的分子离子峰,含有鞣花酸酰基,结合数据库分析确定峰成分7为Verbasoside。峰8给出准分子离子m/z为247.0250[M-H]-(图6h),结合数据库资源确定峰成分8为7-Deshydroxypyrogallin-4-Carboxylic Acid。峰10产生m/z为465.1557[M-H]-的分子离子峰,m/z 301.0005和m/z 169.0146分别为鞣花酸和没食子酸的分子离子峰,因此确定峰成分10为Polystachin(黄酮)。峰11是一种木质素类的成分,推测为2,2′-二羟基-3,3′-二甲氧基-5,5′-二羧基联苯(DDVA)(2,2′,3-Trihydroxy-3′-methoxy-5,5′-dicarboxybiphenyl)。峰9和峰12均给出准分子离子m/z为433.0432[M-H]-,且均有相应的二级碎片离子m/z 301和m/z 172。推测二者可能为同分异构体,由于m/z 301为鞣花酸分子离子峰,峰9和12可能为鞣花酸衍生物,但它们的确切的分子结构还需进一步研究。峰13荷质比m/z为300.9994[M-H]-,m/z 283.9966为[M-H-H2O]-的碎片离子(图6k),m/z 229.0147是[M-H-H2O-2CO]-产生的碎片离子,m/z 145.0300是[M-H-H2O-2CO]-进一步丢失3分子CO所产生的碎片离子,与文献[36]的离子碎片进行对比,确定峰成分13为鞣花酸(Ellagic acid)。

3 结论

AB-8是纯化龙眼核多酚的理想树脂,静态吸附率解吸率分别为51.36%、96.4%,且能在5 h内达到吸附与解吸的平衡。当乙醇浓度为70%、pH为4时,AB-8树脂的静态解吸效果最好,解吸率达到99.03%。采用HPLC-Q-TOP-MS/MS对龙眼核多酚的主要成分进行鉴定,结果表明龙眼核提取物中含柯里拉京(Corilagin)、诃子鞣质(Chebulagic acid)、鞣花酸(Ellagic acid)等13种主要化学成分,其中6-Hydroxy-alpha-pyrufuran、地榆酸内酯(Sanguisorbic acid dilactone)等8种化合物在龙眼核多酚中龙眼核多酚中未见报道。研究结果将为龙眼核的综合利用提供新的思路,对提高龙眼加工的经济和社会效益以及龙眼产业的持续发展有促进作用。