橘皮与橙皮精油抑菌、抗氧化、抗肿瘤活性研究

郝婧玮，索莲宦，杨斯棋，陈思宇，梅念念，季宇彬

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076； 2.牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157011)

柑橘属芸香科柑橘亚科包括柑、橘、橙、柠檬等品种。柑橘果皮主要由外果皮、中果皮、内果皮组成，柑橘皮油胞中含丰富的香精油，约为果皮鲜重的0.5%～2%。精油是采用各种方法在植物的根、茎、叶、花、果皮或果实中提取的具有易挥发性的一类油状液体，能产生浓郁的香味和气味、可以随水蒸气蒸馏出来的油状物质。又称芳香油、香精油(essential oils)、挥发油(volatile oils)[1]。精油具有许多活性成分，例如有酯类、醇类、芳香烃类和酚类萜烯烃类等。精油的挥发性很强，通常需要密封遮光储存。植物精油在医学领域方面：去痛、消炎、调节内分泌、保健、提高免疫力得到广泛的运用，活性成分可祛痰止咳[2]、祛风健胃、驱虫[3]、防皱保养。并且植物精油在化妆品，医药和食品加工等领域也存在广泛的应用价值[4-5]。目前常用的果皮精油提取方法有冷压法、水蒸汽蒸馏法、微波辅助法、超临界二氧化碳萃取法和溶剂浸提技术等[6]。水蒸馏法是一种传统提取方法。它的原理是水分能向皮渣细胞组织渗入，置换芳香精油，在水蒸气操作条件下产生油和水的共沸物，这个过程也存在3种不同的作用原理，分别是扩散、水解和热解[7]。其优点是设备简单、成本低、容易操作出油率高可达1.3%～2.0%[8]。

所提精油可应用到多个方面如护肤用品、食品、烟草等[9]。其中橙皮具有抗氧化、平喘、改善高血压、缓解紧张情绪、改善失眠症状等功效[10]，同时还具有抗真菌成分，可以有效抑制黄曲霉的生长、清除自由基[11]。关于橙皮的菌性，近年来有很大进展，橙皮精油可以的抑制黑曲霉和黄曲霉的生长[12-13]，且这种影响随着浓度的增大而加强。橙皮及橘皮精油含有醇类，酮类，不饱和脂肪酸等物质成分有良好的抗氧化性能。对果皮精油的抗氧化性能讨论研究，可以进一步扩大桔皮的应用领域，对果皮加以高值化综合利用与开发。最近研究表明，精油及其主要成分在抑制肿瘤细胞增殖方面或减小实体瘤大小方面非常有效，其作用机制是精油作为氧化剂使细胞内产生大量自由基，导致细胞坏死或凋亡。精油具有很强的非基因水平的细胞毒性，具有抗癌作用，因此激发人们从精油中寻找天然抗癌药物，抗肿瘤精油的筛选无疑成为研究的主要环节[14]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鲜橘皮、鲜橙皮；细胞株：HepG-2细胞，上海斯信生物科技有限公司；96孔细胞培养板：Corning公司；胎牛血清：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胰蛋白酶-EDTA培养液：源叶生物；100×青霉素-链霉素溶液：biosharp；溴化四唑蓝MTT(AR)、二甲基亚砜DMSO(AR)：Sigma公司；DMEM培养基：Gibco公司。

1.2 实验仪器

微型高速粉碎机：上海赛山粉体机械制造有限公司；电热鼓风干燥箱(型号DHG-9055A):上海一恒科学技术有限公司；智能冰箱(型号BCD-206TASJX)：青岛海尔股份有限公司；电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电子控温加热套：金坛市荣华仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计(型号UFJ-7200型)：上海尤尼科仪器有限公司；台式高速冷冻离心机(型号ALLEGRA-64RCentrifuge)：美国贝克曼公司；生物安全柜(型号BHC-1300IIA2)：苏州净化设备有限公司；显微镜(型号OLYMPUS IX70)：南京瞭望光电技术有限公司；全自动酶标仪(型号Thermo Multiskan MK3)：美国Thermo公司；超净工作台(型号DL-CT2N)：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 精油提取

果实洗干净，剥皮，80℃烘干至恒重，粉碎成细粉。将称取好的40 g粉碎后的橙皮和桔皮，置于500 mL的圆底烧瓶中，加入400 g蒸馏水浸泡6 h，料液比1∶10。以索式提取器为主要仪器连接好装置，加热回流4 h，用吸量管吸取表面油层，称量重量，重复提取至不再有精油蒸出。如下列公示计算精油得率。

精油得率(%)=精油质量(g)/样品质量(g)×100%

1.3.2 精油抑菌实验研究

精油浓度配制采用二倍稀释法[14]，用无菌移液枪吸取3 mL橘皮精油和3 mL丙酮溶液放入灭菌的塑料管内，配制浓度为50%的橘皮精油溶液，混合均匀后，取3 mL混合溶液加入另一个无菌塑料管内，再加入3 mL丙酮溶液，混合均匀，重复上述步骤，以此制得浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78(V/V%)的橘皮精油溶液。以丙酮溶液为空白作对照试验。

橙皮精油溶液配制与橘皮精油溶液配制方法相同。

吸取0.1 mL配制好的菌悬液，加入固体培养基上，将菌悬液涂抹均匀，制成带菌平板，将皿平分三等份，每份放入一6 mm滤纸片，吸取0.03 mL精油溶液于滤纸片上，另有一平板分为两等份，加入0.78%精油和丙酮溶液。橘皮、橙皮精油操作相同。标记好相应浓度后，放入37℃恒温培养箱培养24 h，用直尺测量抑菌圈直径，得到指示菌抑菌效果。比较精油对几种菌的抑菌效果。

采用二倍稀释法时仍以丙酮溶液[15]为溶剂，按上述方法将橘皮精油和橙皮精油配制成浓度依次为 50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78(V/V%)的精油溶液。将加热的及配制好的精油倒入培养基中，使二者均匀混合，最后使培养皿中精油浓度分别为 50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78(μL/mL)。将培养皿放置冷却后，接种细菌，将含菌平板放入恒温培养箱中，温度设置为37℃，培养24 h后观察结果，与对照组(菌落正常生长)进行比较，肉眼即可辨别生长良好的则无抑制作用，以菌落生长完全受到抑制的最低精油浓度作为最低抑菌浓度(MIC)，用丙酮溶液作为对照分别测得橘皮精油和橙皮精油对几种指示菌的MIC。

将上述没有菌落生长的培养皿继续放入恒温培养箱中，温度设置为37℃，24 h后取出，以没有菌落生长的最低浓度作为作为精油的最低杀菌浓度(MBC)，仍以丙酮溶液作为对照。分别测得橘皮精油和橙皮精油对几种指示菌的MBC。

1.3.3 精油抗氧化实验研究

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)醇溶液显鲜艳紫色，在517 nm处有最大吸收值，DPPH自由基清除实验中，被测样品给出的氢原子与DPPH自由基结合，最大吸收波长517 nm处吸光值有所下降，并且下降趋势呈线性关系，吸光度水平的降低表示抗氧化性增大，以测定试验样品的抗氧化能力。精密称量DPPH 0.256 1 g，无水乙醇试剂定容到1 000 mL，浓度约6.5×104mol/L摇晃均匀，避光保存，用前稀释10倍。精油对DPPH清除作用：取3支具塞试管，分别标记1、2、3.2 mL DPPH溶液和2 mL 10%的精油溶液(精油溶于无水乙醇配好)，置于具塞试管中，作为A1。取2 mL DPPH溶液和2 mL无水乙醇溶液，加入到具塞试管中，作为A2。取2 mL两种不同精油溶液和2 mL无水乙醇溶液，加入具塞试管里，作为A3。将三支具塞试管中溶液摇匀，放入黑暗条件反应30 min，反应结束后，于最大吸收波长517 nm处分别测量吸光度值。为证明精油抗氧化能力强，取同体积同浓度的维生素E代替精油形成对比。操作条件相同。

清除率%=[1-(A1-A3)/A2]×100%

A1：DPPH溶液与两种不同精油的混合溶液的吸光度值。A2：DPPH溶液和无水乙醇溶液的混合溶液的吸光值。A3：两种不同精油和无水乙醇溶液的混合溶液的吸光值。利用Fenton反应产生羟自由基：H2O2+Fe2+→·OH + H2O+Fe3+，在反应溶液中加入水杨酸，Fenton反应产生的羟自由基可与水杨酸反应，生成在510 nm处有吸收的物质2，3-二羟基苯甲酸。选择固定反应时间法，于波长510 nm测量含有被测样品反应液的吸光度值，并和空白液对比，以确定受试样品羟自由基的清除能力。比色管中依次加9 mmol/L FeSO4，9 mmmol/L乙醇-水杨酸，加入适量的无水乙醇，加入8.8 mmol/L H2O2后摇晃均匀，37 ℃水浴环境加热20 min之后取出，测量吸光度值A0。如上述方法，加入各溶液体系，来测定吸光度A1，A2羟自由，基清除率(%)=[A0-(A1-A2)/A0]×100%，其中 A0为空白对比的吸光值，A1为加样品的吸光度值，A2为不加显色剂H2O2的吸光度值。

1.3.4 精油抗肿瘤实验研究

将对数生长期细胞在96孔培养板中培养，用含10%新生小牛血清培养液配制细胞悬液，细胞计数为每孔体积为100 μL含有细胞数约为104个。将96孔板放置于37℃和5% CO2饱和湿度条件下的培养箱中培养8～12 h，直至其贴壁。每孔加入用PBS配制的梯度质量浓度的精油20 μL，按以下顺序：0.2 mg/mL，2 mg/mL，20 mg/mL，继续培养44 h。每孔加入20 μL MTT溶液继续培养4 h。向每个孔中加入150 μL DMSO，摇晃并震荡10 min以充分溶解甲瓒结晶物，显示蓝紫色。在酶联免疫检测仪上选择490 nm，用空白校正，测定各孔的吸光度A，计算抑制率。

抑制率=(对照组平均吸光度值-加药组平均吸光度值)/对照组平均吸光度值×100%

按上述方法操作，在96孔板上，将橙皮精油和橘皮精油药物组分别按浓度梯度为0.2 mg/mL，2 mg/mL，20 mg/mL从左至右，从上至下依次加入，对照组(即只加细胞不加药物)也如此，并于加MTT前取样镜检。

2 结果与分析

2.1 两种精油抑菌效果

橘皮精油对三种指示菌都有一定的抑菌能力，但对金黄色葡萄球菌的抑菌能力最强，浓度比为50(V/V%)时抑菌直径可达到17.6 mm。对枯草芽孢杆菌的抑菌能力次之，浓度比为50(V/V%)时抑菌直径可达到16.4 mm。而对变形杆菌的抑菌能力最弱，浓度比为50(V/V%)时抑菌直径只可达到11.4 mm(见图1)。

图1 不同浓度橘皮精油对三种指示菌的抑菌直径

由图2可知橙皮精油对变形杆菌的抑菌能力较差，浓度为50(V/V%)时抑菌直径为13.4 mm，对枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力强于变形杆菌，50(V/V%)时枯草杆菌的抑菌直径为15.4 mm，而金黄葡萄球菌的抑菌直径为16.4 mm。

图2 不同浓度橙皮精油对三种指示菌的抑菌直径

图3 精油原油及抗生素对对三种指示菌的抑菌直径

由图3可看出橘皮精油和橙皮精油对上述菌种均有抑制作用，二者对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，对枯草芽孢杆菌效果次之，对变形杆菌作用最弱。头孢氨苄对变形杆菌的抑制作用最强，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌次之。

通过不同浓度橘皮精油及橙皮精油对金黄色葡萄球菌的作用，得出橘皮精油及橙皮精油的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度(见表1)。

表1 橘皮精油及橙皮精油对金黄色葡萄球菌最低抑菌 浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)

2.2 两种精油抗氧化效果

由图4可以得出橘皮精油对DPPH清除率为33.8%，橙皮精油对DPPH清除率为41.0%，维生素E对DPPH清除率为25.1%。维生素E清除率较橘皮和橙皮精油低，证明橘皮和橙皮精油有较好清除率，较高抗氧化能力。

图4 三种物质DPPH清除率对比柱形图

羟自由基具有超强的氧化能力，能破坏活体组织中的蛋白质、核酸、糖类等大分子而引起氧化性破坏。Vc具有很强的还原能力，可与(OH-)发生氧化还原反应降低对机体的危害。同时，橘皮、橙皮精油中的萜烯类成分含有不饱和键，亦可对(OH-)氧化而对其起到一定清除作用，由图 5可知相同浓度波长517 nm下的桔皮精油和橙皮精油对羟自由基的清除率分别为62.3%，54.1%。维生素E对羟自由基的清除率是14.1%。维生素E对羟自由基清除率没有橘皮、橙皮精油高，证明橘皮、橙皮精油有较强抗氧化能力。

图5 三种物质对羟自由基清除率对比柱形图

2.3 两种精油抗肿瘤活性鉴定

从图6可看出，橙皮精油抗肿瘤的效果较橘皮精油的较优，橘皮与橙皮精油均具有很强的抗肿瘤细胞的活性，精油浓度差异对肝癌细胞的抑制率变化并不十分明显。

图6 不同浓度精油对HepG-2肝癌细胞的抑制率

3 讨论

随着科技的进步和人类的健康意识加强，人们更加倾向于自然且对人体伤害更小的商品添加剂。而精油恰好能满足人们的要求，植物精油由植物本身提取，是植物的次生代谢产物，因为具有抑菌活性、抗氧化性、来源广泛等特点，深受人们喜爱。如柑橘类精油，占鲜质量0.5%～2.0%[15]，主要源于自身外果皮细胞。这一发现可以解决工业生产中废弃果皮的处理方式，如果善加利用废弃果皮的处理方式，不仅可以减小环境压力也可以减少资源的浪费，将会得到环境和经济的双重效益[16]。因柑橘精油对食品中腐败菌和病原菌有较好的抑制作用，可用于食品行业[17]。减少防腐剂的大量使用，增加食品的安全性。

在DPPH自由基清除实验中，试验样品给出的氢原子和DPPH自由基结合，最大吸收波长517 nm处的吸光值有所下降，下降趋势呈线性关系，吸光度水平的下降代表抗氧化活性增强，从而测试试验样品的抗氧化能力。对羟自由基的清除作用包括挥发性精油植物源提取物，其既可作用自由基氧化过程中反应链之前的非链过程，也可清除启动链反应中的OH-，清除链并延伸自由基，发挥预防型断链型抗氧化的双重作用，从而阻碍或清除自由基的生成。桔皮橙皮精油中的萜烯类化合物含有双键，可加成(OH-)形成二级基团，由此清除体系中大部分(OH-)，达到抗氧化目的。精油发挥抗氧化性主要是其富含的酚类成分，可清除自由基，并与金属离子螯合，抑制细胞膜质氧化和调节抗氧化酶发挥作用，具有一定程度的抗氧化能力。

橘皮与橙皮精油中的柠檬烯含量丰富。柠檬烯也成为苎烯，单萜类化合物，无颜色的油状液体，其味道与柠檬相似。具有良好的化痰镇咳、抗菌作用，复方柠檬烯可临床用于溶石、利胆、排除肠内积气和促进消化液分泌。在化学水平上，精油对免疫系统有积极作用，其提高了白细胞的活性，用于除去体内的细菌和异物，使它们更有效。精油主要成分的活性很可能受到其他次要分子调节的。橙皮精油抑制肿瘤细胞的效果比橘皮精油好些，可能是因为橙皮中的柠檬烯含量较橘皮中的多。