童子益母草质量标准提升研究

孙芸，班小军，杨玺文，陈晓青，赵翠琴，谢世斌，张建民

(张掖市食品药品检验检测中心，甘肃 张掖 734000)

童子益母草为唇形科植物益母草Leonurusartemisia(Lour.)S. Y. Hu的干燥幼苗或基生叶，具有活血调经，利尿消肿，清热解毒作用，用于月经不调，痛经闭经，恶露不净，水肿尿少，疮疡肿毒[1]。其主要化学成分，生物碱：益母草全草含生物碱 0.11%～2.09%，其中益母草碱(1eonurine)0.02%～0.12%、水苏碱(stachydrine)0.59%～1.72%和益母草啶(1eonuridine)、益母草宁(1eonurinine)，其主要成分为盐酸水苏碱[2]，从主要化学成分来看，水苏碱在全草生物碱中含量比例最高，所以本标准确定含量测定的生物碱成分首先确定盐酸水苏碱。童子益母草虽然没有被《中国药典》收载，但作为商品已经在市场上流通使用，近年来，童子益母草常在中药处方中应用，不仅作用疗效好，且价格低廉，深受广大患者认可。但目前，我国中药材质量现状还不容乐观，特别在我省，由于中药材地方标准水平偏低，道地中药材及饮片质量失控现象也比较严重，不能有效地控制其质量，对广泛推广种植带来了滞后。所以，只有提升了中药材及中药饮片的检验质量标准，才能从源头上更好地控制中药材及饮片的质量，起到推动我国中医药产业链的持续发展的作用。

原《甘肃省中药材标准》[3](2009年版)童子益母草标准项下仅有性状。为了进一步控制该药材的质量，本标准增加了药材粉末鉴别、薄层鉴别、水分、总灰分、浸出物，并采用 HPLC-ELSD法测定了童子益母草中盐酸水苏碱。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司);LT-Ⅱ蒸发光散射检测器(日本岛津公司)；TLC Visualizer薄层成像系统(天津大学无线电精密仪器厂)；鼓风干燥箱( 北京科伟永新仪器有限公司)；PH100显微成像系统(凤凰光学仪器有限公司)。

1.2 试药

乙腈为色谱纯；其它化学试剂均为分析纯；水为纯化水；盐酸水苏碱批号110712-201312，含量为99.4%，来源：中国食品药品检定研究院；童子益母草10个批次(产地：甘肃河西地区三个不同种植地)。

2 方法与结果

参照《中国药典》2015年版一部及相关文献资料，确定提升标准的项目进行研究。

2.1 鉴别

参照《常用中药鉴定大全》[4]益母草项下粉末鉴别及《中国药典》2015年版一部[1]益母草项下薄层色谱鉴别方法。

2.1.1 粉末显微鉴别

(1)非腺毛较多。非腺毛1～4细胞。大多向一侧偏弯，完整者35～115 μm，顶端细胞约占全长的1/2～2/3，直径8～25 μm，壁厚2～10 μm，表面有细小疣状突起。(2)腺麟稀少。顶面观类圆形或椭圆形，直径33～50 μm，柄极短。(3)小腺毛头部1～4个细胞，侧面观类圆形，微扁，直径18～27 μm，柄短，1～2个细胞。(4)叶片表皮细胞呈多角型，垂周壁平直。(5)草酸钙针晶细小存在于叶肉细胞中，直径3～17 μm。(6)草酸钙方晶呈方形、菱形或多面体，直径3～15 μm。(7)导管以螺纹导管为主，也可见梯纹、网纹及具缘纹孔导管。见图1。

2.1.2 TLC鉴别

取盐酸水苏碱项下的供试品溶液10 mL，蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加无水乙醇使溶解(制成每1 mL含1 mg的溶液)，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-无水乙醇-盐酸(10∶6∶1)为展开剂，展开，取出 ，晾干，在 105℃加热15 min,放冷，喷以稀碘化铋钾试液-三氯化铁试液(10∶1)混合溶液至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。见图2。

注:1、7、12为盐酸水苏碱对照品，2、3、4、5、6、8、9、10、11为样品图2 薄层色谱图

2.2 检查

参照《中国药典》2015年版一部[1]益母草项下水分(干燥法)、总灰分测定方法,对10批不同种植地样品进行了测定。

2.2.1 水分测定结果

见表1。

2.2.2 总灰分测定结果

见表2。

2.3 浸出物测定

参照《中国药典》2015年版一部[1]益母草项下浸出物测定方法,对10批不同种植地样品进行了测定。见表3。

表1 10批不同种植地童子益母草水分测定结果(%)

表2 10批不同种植地童子益母草总灰分测定结果(%)

3 含量测定

参照《中国药典》2015年版一部[1]益母草项下“盐酸水苏碱”测定方法,对10批不同种植地样品进行了测定。

表3 10批不同种植地童子益母草浸出物测定结果(%)

3.1 色谱分析条件

色谱柱为Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-0.2%冰醋酸溶液(80∶20)为流动相；流速1.0 mL/min；柱温 ：30℃；蒸发光散射检测器检测，漂移管温度：45℃。理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于6 000。

3.2 对照品、样品溶液制备

3.2.1 对照品溶液制备

盐酸水苏碱，批号110712-201312，来源：中国食品药品检定研究院，含量99.4%。精密称取盐酸水苏碱对照品12.75 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3.2.2 样品溶液制备

取本品粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇 25 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品和样品的高效液相色谱图，见图3。

图3 盐酸水苏碱高效液相色谱图

图4 样品高效液相色谱图

3.3 线性关系

分别精密吸取上述对照品溶液5、10、15、20、25 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱峰峰面积。以峰面积的常用对数值为纵坐标(Y)，对照品进样量的常用对数值为横坐标(x)进行线性回归，得回归方程：Y=1.263 5x+5.199，r=0.999 9，线性范围为2.5～12.7 μg。

3.4 精密度试验

取上述对照品溶液(盐酸水苏碱浓度为0.51 mg/mL)，重复进样6次，记录色谱峰峰面积，其RSD为0.51%(n=6) 。表明仪器精密度良好。

3.5 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12，24 h，进样量为10 μL，记录色谱峰峰面积，其RSD为0.87%(n=6)。说明供试品溶液中盐酸水苏碱在室温条件下24 h内稳定。

3.6 重复性试验

取同一批样品精密称取6份，按上述测定方法。平行制备供试品溶液6份，进样量为10 μL，记录色谱峰峰面积，其RSD为0.82%(n=6)。

3.7 加样回收率试验

精密称定已知含量的童子益母草供试品6份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入上述对照品溶液 1 mL(0.5 mg)，按“供试品溶液的制备”项方法制备供试品溶液 ，按上述色谱条件进行测定，记录色谱峰峰面积，并计算回收率。平均回收率为102.76%，RSD为1.41%。见表4。

表4 盐酸水苏碱回收率测定结果

3.8 样品的测定

取样品照“3．2．2”项下方法制备供试液，进样10 μL测定 ，照外标法 (峰面积 )计算含量，结果见表5。

表5 10批不同种植地童子益母草盐酸水苏碱测定结果(%)

4 讨论

实验采集的三个不同产地的10批样品都是在甘肃省河西地区人工种植的，拟在原《甘肃省中药材标准》(2009年版)上增加的项目均参照《中国药典》2015年版一部益母草项下方法，检验方法准确，数据可靠，结果真实。通过大量实验表明：童子益母草的药用部位虽然主要是基生叶，但其鉴别、检查、浸出物及含量测定的结果均达到了《中国药典》2015年版一部“益母草”项下的规定限度；特别是盐酸水苏碱的含量超出药典标准规定5倍以上，具有良好的线性关系、精密度、准确度、重现性，方法简便，且可操作性强，为更好地控制甘肃省种植童子益母草质量提供了检验检测方法，是提升中药材质量标准的重要依据，本次标准提升为进一步研究童子益母草奠定了基础。