连翘叶中连翘苷元制备工艺的研究

邓祥敏，朱星宇

(江苏护理职业学院，江苏 淮安 223005)

连翘为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb．)Vahl的干燥果实，功效清热解毒、消肿散结，《神农本草经》有言：“本品主寒热，痈肿恶疮，瘰疬，瘿瘤，结热。”临床常用于风热感冒、温病初起、高热烦渴、痈疡肿毒、小便淋闭等的治疗[1-2]。现代研究发现，连翘中主要含有挥发油类、木脂素类、萜类及黄酮类等化学成分[3]，其中木脂素类成分连翘苷元具有抗自由基、抗氧化、保肝等作用[4-5]，但是连翘苷元在连翘果实中含量极低，只有0.008%左右，其连翘叶中连翘苷元含量约为果实中的5～8倍[6-7]，因此从连翘叶制备连翘苷元更具可行性。目前连翘苷元的制备方法主要有微生物转化法[8]、纤维素酶水解法[9]等，具有工艺复杂，可操作性差，难以规模化生产等缺点。

本实验研究了连翘叶中连翘苷元的制备工艺，具有效率高、成本低、周期短、易于推广的优点。制备得到纯度大于99.0%的连翘苷元单体化合物，为连翘苷元的制备工艺研究以及连翘叶的进一步开发利用提供参考。

1 仪器与材料

AG-135型电子分析天平(梅特勒公司)；安捷伦高效液相色谱仪Agilent1100(美国安捷伦公司)；GL-10M高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)。

连翘叶购于淮安市广济医药连锁有限公司(产地山东，批号：20160907)，药材饮片经黑龙江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb．)Vahl的干燥叶；连翘苷元对照品(批号：170521，宝鸡市生物辰光生物科技有限公司，纯度>98%)；甲醇为色谱纯，95%乙醇，乙酸乙酯为分析纯。

2 方法和结果

2.1 分析方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Extent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(用稀磷酸调节pH值至3.2)-甲醇(45：55)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：230 nm；进样量10 μL。对照品与样品色谱图见图1。

图1 对照品(A)和供试品溶液(B)色谱图

2.1.2 对照品溶液配制

精密称取连翘苷元对照品10.00 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.100 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液配制

精密称取取样品约5.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.1.4 标准曲线绘制

分别精密吸取“2.1.2”中对照品溶液适量，分别用甲醇稀释0、2、4、10、20、80倍，按“2.1.1”项下条件测定，以对照品质量浓度(mg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得连翘苷元回归方程为Y=451231.34x+1354.725，r=0.9999。线性范围为:0.013～1.000 μg。

2.2 连翘苷元粗品的制备

2.2.1 提取

根据参考文献[10]并考虑到生产成本与安全环保等，选择水作为连翘叶中连翘苷元的提取溶媒，对连翘苷元粗提物的提取条件进行了单因素考察，结果显示，提取时间在2～5 h范围内对提取率影响很小，可以忽略，从节约成本、降低能耗考虑，提取时间定为2 h；其他三个因素对提取率影响较大，当提取温度为60 ℃、溶剂倍数为20倍、提取次数为2次时，提取率最高。单因素考察因素水平见表1。

表1 单因素考察提取条件

在单因素考察的基础上进行正交试验，以浸膏中连翘苷元含量为指标，考察因素为提取温度(A)、溶剂倍数(B)、提取次数(C)。取连翘叶粗粉9份，每份30 g，加水按照正交试验表对应条件提取，正交试验方案与结果见表2。

由表2、表3正交试验结果可见，提取温度(A)、溶剂倍数(B)、提取次数(C)三个因素对连翘苷元提取率的影响大小顺序依次为：C>A>B，即提取次数影响最大，其次为提取温度和溶剂倍数。理论上最优提取工艺为A2B2C3，但提取次数第2、3水平间差距明显小于第1、2水平间差距，综合考虑成本，确定最优提取工艺为A2B2C2，即60℃下，20倍量水，提取2次。按照最优提取工艺制备连翘提取液，将其减压浓缩至稠膏状。

表2 连翘苷元正交试验设计及结果

表3 方差分析表

2.2.2 醇沉

量取“2.2.1”项所得浸膏3份，每份100 mL，进行单因素考察醇沉条件。方法如下：分别加入2、3、4倍量95%乙醇常温搅拌30 min。醇沉过夜，过滤后取相同体积的滤液稀释至同一体积，即得供试品溶液，以醇沉滤液中连翘苷元含量及醇沉沉淀中连翘苷元含量为考察指标，考察因素与结果见表4。

表4 醇沉考察因素与结果

由表4结果可知，醇沉体积为4倍量时，滤液中连翘苷元含量最高，沉淀中所剩连翘苷元极少，可以忽略不计，因此醇沉工艺条件为4倍量95%乙醇。

2.2.3 萃取反洗

以连翘苷元溶解度为考察指标，采用单因素考察粗提物萃取反洗工艺，结果连翘苷元在水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯中的溶解度分别为0.02,7.86,5.57,39.3,36.9 g·L-1，其中连翘苷元在二氯甲烷和乙酸乙酯的溶解度明显优于水、乙醇和甲醇。其在二氯甲烷和乙酸乙酯中溶解度相近，但二氯甲烷毒性较大，因此优选粗提物萃取反洗工艺定为：乙酸乙酯搅拌萃取，水反洗。具体如下：取“2.2.2”项所得粗提物10 g置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯搅拌萃取30 min。乙酸乙酯相加入纯化水反洗2次，每次30 min。收集乙酸乙酯相，用旋转蒸发仪浓缩至稠膏状，得粗品。粗品含量以连翘苷元计不低于75.0%。

2.3 单次结晶

2.3.1 单次结晶溶剂的考察

以连翘苷元溶解度为指标考察单次结晶溶剂，考察指标与结果见表5。

表5 连翘苷元溶解度的考察

由表5结果可知，连翘苷元在乙酸乙酯中常温与回流状态下溶解度都很大，损失较大，不适合做结晶溶剂。连翘苷元在热乙醇中的溶解度很大，常温下溶解度很小，甲醇中次之。从环保及危害方面综合考虑，选用乙醇作为结晶溶剂。但实验过程中发现，连翘苷元粗提物在乙醇中不易析晶，而在甲醇中很容易析晶。故选甲醇做一次结晶溶剂。

2.3.2 单次结晶条件的考察

精密称取“2.2.3”项下所得连翘苷元粗品10 g，以结晶温度、溶剂倍数、结晶时间三个因素对单次结晶的工艺条件进行单因素考察，结果见表6～8。

表6 单次结晶温度的考察

注：参照2.3.1项溶剂倍数暂定为3倍

表7 单次结晶溶剂倍数的考察

注：结晶温度为0～4℃

表8 单次结晶时间的考察

注：溶剂倍数为3倍，结晶温度为0 ℃～4 ℃

由表6～8可知，单次结晶的最佳条件为3倍量甲醇回流溶解，冷却至室温，0～4 ℃静置析晶48 h，晶体用甲醇淋洗，干燥，即得质量分数大于95%的单次结晶。

2.4 重结晶

2.4.1 重结晶溶剂的考察

称取单次结晶2份，每份10 g，按照“2.3.1”项下方法考察，确定甲醇为重结晶溶剂。

2.4.2 重结晶条件的考察

精密称取单次结晶3份，每份10 g，按照“2.3.2”项下方法，对重结晶最佳工艺条件进行单因素考察，结果显示，以3倍量甲醇回流溶解，放至室温，置于0～4 ℃冰箱内静置析晶36 h，甲醇淋洗析出晶体，减压干燥，可得连翘苷元成品，经检测连翘苷元含量大于99.0%。

2.5 小试工艺验证

将100 g连翘叶药材置于2 L圆底烧瓶中，分别加20倍量饮用水，60 ℃浸提2次，每次2 h，浸提结束，过滤，滤液减压浓缩至密度约1.2 g·mL-1的稠膏，向其加入95%乙醇，调至醇浓度80%左右进行醇沉。抽滤，上清液减压浓缩至无醇味，得粗提物。

将粗提物置于分液漏斗中，加入15.0 mL的乙酸乙酯萃取30 min，将乙酸乙酯相加入纯化水反洗2 次，每次30 min。收集乙酸乙酯相，用旋转蒸发仪浓缩至稠膏状，干燥得粗品并测定其质量分数。

向粗品中加入16.0 mL甲醇回流溶解，0～4 ℃下反复静态析晶，晶体用甲醇淋洗，干燥得单次结晶并测定其质量分数。

向单次结晶中加入13.2 mL甲醇回流溶解，0～4 ℃下反复静态析晶，晶体用甲醇淋洗，干燥得成品并测定其质量分数。

按上述工艺试验3批，进一步确定工艺参数，考察工艺的重复性，相关数据见表9。

表9 3批小试的相关数据

由表9可知，最终得到连翘苷元质量为(3.60±0.05)g (RSD为1.47%)，质量分数为(99.11±0.03)g (RSD为0.03%)，收率稳定，工艺可行，为规模化制备奠定了研究基础。

3 讨论

本研究通过单因素考察和正交试验设计制定了连翘中连翘苷元的最佳制备工艺，实验中涉及提取、醇沉、萃取、单次结晶、重结晶5个主要工艺步骤，最终确定制备工艺为：以20倍量水，在60℃下提取2次，得到提取物以4倍量95%乙醇进行醇沉，再加乙酸乙酯搅拌萃取，得质量分数大于75.0%的粗品，再将粗品采用甲醇进行结晶，可得质量分数大于99.0%的连翘苷元成品。

近年来研究发现连翘苷与连翘苷元的药理活性有明显差异，连翘苷可能是连翘苷元的前体物质[9]，所以研究如何制备连翘苷元，对连翘资源深度开发具有重要意义。现有的连翘苷元制备工艺首先是制备连翘苷，然后用微生物或者纤维素酶水解，将其转化为连翘苷元，如此放大生产周期长、成本高、可操作性差，不适合规模化制备连翘苷元。在实验设计初期我们尝试在提取过程中加入酸水解这一步骤以期促进连翘苷水解成连翘苷元，从而增加其得率，但是发现由于连翘苷水解产生的副产物较多，构型容易转变，生成的同分异构体难以分离，难以实现后期连翘苷元的分离纯化，因此采用直接提取连翘苷元的方法。

本研究摒弃由连翘苷制备连翘苷元的传统方式，由热水浸提醇沉再精制的方法直接制备连翘苷元，其过程仅用了乙酸乙酯、甲醇两种溶剂，有机溶剂种类少，用量少，安全性高。本研究制定的连翘苷元制备工艺与传统工艺相比，具有操作简单、工艺用时短、所得连翘苷元成品纯度高的优势。经3批小试工艺验证，可见该制备工艺稳定、可行，可为试验和生产中连翘苷元的制备提供一种切实可行的工艺，并进一步扩大连翘苷元的应用和开发。