肝胃百合汤对慢性应激胃溃疡模型小鼠Th1/Th2细胞平衡及HPA轴的影响

徐寅，喻斌

(湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

慢性应激性胃溃疡是一种特殊类型的胃溃疡，是指在长期严重心理应激状态下或长期服用对胃黏膜有损害的药物所致的胃黏膜病变。其发病机制可能与神经内分泌调节、体液免疫反应异常、胃黏膜损伤因素增强或屏障机制减弱、心理应激等有关。前期研究[1-3]发现肝胃百合汤能有效改善胃溃疡肝胃气滞证患者的临床症状，可能通过减少白介素-1(IL-1)、TNF-α等炎性介质产生，上调抗炎因子白介素-10(IL-10)的水平，促进表皮生长因子(EGF)的表达，从而修复胃黏膜、抗炎症反应的治疗作用。本实验在前期研究的基础上，探讨肝胃百合汤对慢性应激性胃溃疡的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康BALB/c小鼠(SPF级)40只，均为雄性，6周龄，体质量19～22 g，小鼠购进后常规适应性饲养3 d，动物饲养环境：温度20～25 ℃，湿度50%～70%，无不良反应者可纳入实验。实验动物均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK(湘)2011-003。

1.2 实验药品

1.2.1 肝胃百合汤

处方：百合15 g，柴胡9 g，郁金9 g，乌药9 g，川楝子9 g，丹参9 g，白芍9 g，蒲公英15 g，甘草6 g，均购自于湖南中医药大学第一附属医院中药房。将上述饮片放入凉水中，并没过药物5 cm，浸泡30 min后用武火煎煮至沸腾，再用文火煎煮20 min，过滤药汁。再用相同方法煎煮第二道，将两次煎煮的药汁混合后过滤，浓缩至每1 mL含生药1 g，放置于离心机中去掉残渣，4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2.2 盐酸雷尼替丁胶囊

产自佛山手心制药，规格为0.15 g/粒，30粒/盒，批号1602224。

1.3 主要实验仪器及试剂

摇床(其林贝尔TS-92)，恒温箱(北京六一DYY-6C)，净化工作台(YJ 1450)，高速冷冻离心机(TCL16M)，冷冻切片机(莱卡)，切片机(浙江金华益迪试验器材)，包埋机(常州中威电子仪器)，普通冰箱(荣事达)，精密pH计(雷磁)，数码凝胶图像处理系统(GIS-1000)，奥林巴斯摄像显微镜(PM 8AD)，Image-Pro-Plus图像分析软件(Media Cybernetics)。IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、GC、ACTH、CRH酶联免疫分析试剂盒均购自于Bio-swamp生物技术公司。

1.4 动物分组及模型制备

将动物适应性饲养3 d后称质量，按体质量分层随机分为空白组、模型组、中药组、西药组，每组10只，用苦味酸标记后分组饲养。按照相关文献[4-5]选取10种不可预知刺激因素制备慢性应激小鼠模型，并依据前期预实验改进方法，具体方法如下：①潮湿垫料+倾斜饲养、热水泳、禁食24 h、禁水24 h、夹尾5 min、行为束缚、陌生物品、昼夜交替、陌生气味。每天随机从上述10种刺激方式中选取1种，需避免前后两天使用同一种刺激方式。每日上午9点更换刺激方法，连续造模28 d。空白组常规饲养，自由摄食。分别于造模前、造模第14天、第28天观察小鼠行为学的改变，利用旷场试验计算各组小鼠水平、垂直、清洁评分，应较空白组明显减少。抽样采集小鼠胃组织黏膜，肉眼下及光镜下发现溃疡及糜烂。同时符合以上表现则表明模型制备成功。

1.5 给药方法及途径

造模14 d后中药组给予肝胃百合汤灌胃，给药量为12.2 g/(kg·d)。西药组给予盐酸雷尼替丁胶囊(60 kg成人每次用量0.15 g，2次/d)，给药前用蒸馏水溶解，给药量为40 mg/(kg·d)。空白组与模型组则给予同等换算体积的蒸馏水灌胃，灌胃容积按照1 mL/(100 g·d)体质量换算。在每日更换造模方法前1 h每组分别给予相应药物或蒸馏水灌胃。

1.6 观察指标及检测方法

实验过程中观察小鼠毛色、精神状况、饮食量、大便情况、行为变化等。利用旷场试验观察小鼠水平得分(小鼠四爪全部穿越的方格数，每完全通过1次计1分)、垂直得分(小鼠直立、前爪离开地面或爬在墙壁的次数，每次计1分)及清洁评分(小鼠清洁自己皮毛的次数，每清洁1次计1分)。每次评定完后均应清理干净小鼠留在箱内的排泄物，防止影响下个动物的评定。取小鼠血清，按照ELISA试剂盒操作步骤检测IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、GC、ACTH、CRH的含量。

1.7 统计方法

2 结果与分析

2.1 各组小鼠一般行为学变化

空白组小鼠精神良好，毛发浓密，富有光泽，食量正常，活动如常，二便正常，体质量有所增长。造模后模型组、中药组及西药组小鼠精神欠佳，萎靡不振，毛发缺乏光泽，食量明显少于同期空白组小鼠，喜欢聚集，倦怠少动，反应迟缓，大便颜色变深甚至出现黑便，体质量增长幅度缓慢。各组小鼠给予相应灌胃处理后，模型组小鼠精神状况、食量、活动及大便情况与前相比，未见改善，体质量增长缓慢。中药组小鼠精神状态改善，毛发逐渐恢复光泽，反应灵敏，活动增多，食量逐渐增加至造模前水平，体质量增长幅度较前增加，大便逐渐正常，未再出现黑便。西药组小鼠精神状态较前稍有改善，毛色无明显改变，食量较前稍有增多，大便颜色仍较深，但未再出现黑便。

2.2 造模前及治疗后各组小鼠旷场实验评分结果

各组小鼠在造模前行为学指标与体质量组间相互比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模14 d后模型组、中药组、西药组小鼠水平、垂直、清洁得分明显下降，体质量增长缓慢，与空白组相比，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 造模前及治疗后各组小鼠旷场实验评分结果(n=10，分，

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01；与西药组比较，▲P<0.05

2.3 各组小鼠胃黏膜病理改变

光镜观察下，空白组胃黏膜光整平滑，无明显充血、水肿，极个别可见少量点状糜烂，未见溃疡及出血点，可见少量炎性细胞浸润。模型组胃黏膜充血、水肿明显，可见散在糜烂及点状溃疡，上皮破损，炎性细胞浸润明显。西药组胃组织表面尚光整，面膜充血、水肿，可见较多点状糜烂，未见明显溃疡，有较多炎性细胞浸润。中药组胃组织表面比较光整，部分黏膜轻度充血、水肿，有少量点状糜烂，未见明显溃疡，有少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 各组小鼠胃组织病理HE染色图片(×400倍)

2.4 各组小鼠治疗后溃疡指数

各组灌胃后，与模型组相比，西药组、中药组UI数值明显降低，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。中药组UI与西药组相比较低，差异有统计学意义(P<0.05)，中药组溃疡抑制率明显高于西药组。结果表明肝胃百合汤可明显降低小鼠溃疡指数，促进溃疡愈合。见表2。

表2 各组治疗后溃疡指数及溃疡抑制率比较

注：与模型组比较，△P<0.01；与西药组比较，#P<0.05

2.5 各组小鼠血清中GC、CRH及ACTH含量

与空白组比较，模型组血清GC、CRH、ACTH的含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。中药组、西药组上述各指标含量与模型组相比明显减少，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。肝胃百合汤组上述各指标含量低于雷尼替丁组，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表3。

表3 各组小鼠血清中GC、CRH及ACTH含量

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△△P<0.01；与西药组比较，▲P<0.05

2.6 各组小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的含量

与空白组比较，模型组血清IL-2、IFN-γ含量明显升高，IL-4、IL-10的含量明显降低，差异有显著统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，中药组与西药组血清IL-2、IFN-γ减少、IL-4、IL-10的含量升高，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。中药组与西药组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，治疗后的水平更接近空白组。见表4。

表4 各组小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10含量

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01；与西药组比较，#P<0.05

3 讨论

社会压力的日益加大，使得越来越多的人群处于慢性心理应激状态。机体长期已久的处于应激状态下，可能导致免疫能力、抗病能力下降，从而产生多种疾病；由慢性心理应激诱发的各种疾病受到了人们更多的关注。根据其他文献研究[4-5]及前期预实验，我们选取了10种可行性较高的慢性应激的造模方法，随机选取给予造模；为了成功模拟慢性应激，需要适度强度刺激以避免由过度强度引起的急性应激；一般情况下，慢性应激的时间需在21 d以上，于是我们采取了28 d以模拟充分的应激时间。依据造模过程中旷场试验小鼠行为学的改变以及治疗前后解剖并活检的小鼠胃黏膜改变，足以说明运用此种方法可以复制比较理想的慢性应激胃溃疡小鼠模型。

实验研究发现，慢性应激能改变胃黏膜的炎症和免疫反应[6]。慢性应激通过对神经-内分泌-免疫系统的影响，逐渐产生大量炎症因子，随着炎症因子含量升高引起胃黏膜损伤。Th1细胞可由IL-12、IFN-γ诱导而分化，产生IL-2、IFN-γ、IL-12等，同时可抑制Th2细胞的增长；IL-4可诱导Th2细胞分化产生IL-10并与IL-10等细胞因子一起抑制Th1细胞增殖。研究指出，胃溃疡患者血清IL-2、IFN-γ水平较健康人群高，炎症因子随着机体防御系统的启动释放，当炎症因子达到一定水平后，会打破机体免疫防御系统的平衡，导致机体无法继续正常的产生免疫应答，过度反应增加IL-2、IFN-γ的分泌，并参与胃黏膜损伤过程而加重患者病情。而IL-4、IL-10能抑制Th1细胞产生IL-2和IFN-γ，发挥抗炎作用。本研究发现，模型组小鼠血清IL-2、IFN-γ含量增高，IL-4、IL-10的含量下降，本实验论证了慢性应激胃溃疡小鼠存在着Th1/Th2细胞失衡，提示Th1/Th2细胞失衡可能是慢性应激胃溃疡的病理基础之一。

HPA轴是以下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal)兴奋为主的神经内分泌反应。过度的尤其是慢性应激反应引起HPA轴持续激活，造成糖皮质激素浓度长期处于高水平状态，从而导致机体出现不同程度的生理、心理障碍，甚至引起躯体疾病。研究认为[7]，机体神经内分泌功能失调，胃黏膜损伤因子作用相对增强，保护因子及其机制削弱等多方面因素都与应激性溃疡的发生有关。其发生的中枢机制可能是通过下丘脑-交感神经系统、下丘脑-迷走神经系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)发挥作用，并进一步影响胃酸分泌及胃黏膜血流量导致溃疡产生[8]。慢性应激能改变胃黏膜的炎症和免疫反应，黏膜免疫系统可以由中枢神经系统通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)和糖皮质激素(GC)产物调节。同时慢性应激也可以影响HPA轴，上调GC的代谢产物，从而影响胃黏膜。其中，糖皮质激素可以使胃壁细胞数目增多，胃酸和胃蛋白酶分泌增多，导致胃黏膜糜烂、溃疡愈合延迟[9]，同时糖皮质激素还抑制胃黏膜细胞更新，破坏胃黏膜的完整性，以及HPA轴的亢进使得机体对外源性应激因子的易感性增加，都被认为是HPA轴功能异常而导致胃肠道损伤的途径。本研究结果提示模型组小鼠血清GC、ACTH、CRH均升高，证实了慢性应激胃溃疡小鼠HPA轴的失常。

中医学无“胃溃疡”病名，根据慢性应激的临床表现多认为本病与“胃脘痛”“胃疡”更为接近，病位多责之于肝、胃、脾。慢性应激性胃溃疡从现代医学角度来说，多与心理应激因素有着重要的关系。肝胃百合汤由已故名老中医夏度衡教授创制，夏老根据古时历代医家著作及自身多年行医经验，提出“后天脾胃难离肝”的观点，在遣方用药时非常重视肝胃之间的关系。肝胃百合汤对慢性应激胃溃疡小鼠胃黏膜损伤的干预作用，且效果优于H2受体阻滞剂(雷尼替丁)，可能是通过使Th1细胞合成IL-2、IFN-γ的能力相对降低，分泌到血浆中的IL-2、IFN-γ也随之减少，使炎症反应减轻，同时Th2细胞分泌的IL-4、IL-10水平也上调而抑制了炎症细胞因子的产生，Th1/Th2细胞间的失衡也得以纠正；减少GC、CRH、ACTH分泌，使糖皮质激素正常发挥对HPA的负反馈机制，以减轻并修复胃黏膜损伤，促进溃疡愈合。本研究结果提示肝胃百合汤治疗慢性应激性胃溃疡不仅局部修复胃黏膜损伤，且调控Th1/Th2细胞间平衡和调节HPA轴，从神经内分泌免疫网络途径减少胃黏膜损伤，修复胃黏膜，治疗慢性应激胃溃疡。