3种新型蛋白酶体抑制剂对斑马鱼心脏毒性的评价

胡丙雪，董 雪，范宏伟，朱永强，张 茵，张 朝

（南京师范大学生命科学学院，江苏省分子与医学技术重点实验室，南京210023）

近年来，斑马鱼作为模式生物在药物研发、药物安全性、毒性和有效性评价及疾病模型建立等方面得到了很大应用。较之于传统啮齿类动物模型，斑马鱼在诸多方面具有优势，包括在基因和病理特征等方面与人类的高度同源性，实验周期短，适于高通量应用以及胚胎期呈透明可实时观察心脏形态［1-4］。一些研究已经证实，斑马鱼在体内筛选心血管毒性方面是一种具有高度预测性的动物模型［5-8］。在毒性刺激下，斑马鱼心脏会出现心包水肿、心室变小、心动过缓、血流缓慢、心脏发育相关基因的表达也会受到不同程度的影响［5-10］。

Carfilzomib（卡非佐米，商品名：Kyprolis®）和Ixazomib（伊沙佐米，商品名：Ninlaro®）是已上市的第2代蛋白酶体抑制剂类抗肿瘤药物，分别于2012年和2015年被美国FDA批准用于治疗难治性多发性骨髓瘤（relapsed refractory multiplemyeloma，RRMM）。然而，在 carfilzomib和 ixazomib的应用过程中有心脏不良事件的发生［11-13］，而在carfilzomib的使用说明书中，心搏停止、充血性心衰、心肌缺血等心脏不良反应也被列在了注意事项与副作用的第一条。NNU395是在carfilzomib结构基础上改构合成的新的蛋白酶体抑制剂，而NNU458和NNU459是在ixazomib结构基础上改构而来（图1）。前期细胞实验和动物实验已经表明，改构合成的化合物较之前体具有更强的抑制蛋白酶体的活性，更好的抗肿瘤效果和更低的副作用，但3种化合物对心脏的毒性作用仍有待考察。

本研究以模式生物斑马鱼作为研究对象，通过在体内水平初步评价全新合成的新型蛋白酶体抑制剂NNU395、NNU458和NNU459的心脏毒性，为其进一步开发应用提供实验依据，为药物研发过程中心脏毒性风险预测提供实验依据和指导。

1 材 料

1.1 药品与试剂

NNU395、NNU458和 NNU459由南京师范大学生命科学学院朱永强教授实验室自主合成，纯度大于95%，用DMSO溶解为10 mmol／L母液后再用斑马鱼养殖水稀释至所需实验浓度。TRIzol RNA提取试剂（美国赛默飞世尔公司）；逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（北京宝日医生物技术有限公司）；PCR荧光定量试剂盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）。

1.2 仪 器

TI-S荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；MVX10荧光体视显微镜（日本奥林巴斯公司）。

2 方 法

2.1 斑马鱼的养殖与处理

年龄小于6 hpf（6 hours post fertilization）的 TU（Tuebingen）系斑马鱼卵由南京大学模式动物研究所赵庆顺实验室提供。挑选所需数量正常发育的斑马鱼卵置于六孔板中，用专用养殖水在温度（28±1）℃、pH（7.0±0.5）、14 h明／10 h暗光照周期条件下培养。斑马鱼卵培养至6 hpf时，培养液更换为含不同浓度待测化合物的养殖水。根据预实验的结果，carfilzomib的给药浓度为5、10、50、100、150、200、250 和 300 μmol／L，NNU395给药浓度为 1，10，50，100，120，150，200，220和 250μmol／L，ixazomib的给药浓度为5，10，20，30，40和 50 μmol／L，NNU458和NNU459的给药浓度为 0.1，1，10，20，30，40和50μmol／L，同时设置不含化合物的纯养殖水培养的对照组，给药时间为6～72 hpf，每隔12 h显微镜下挑出死卵并统计。

2.2 斑马鱼心脏形态的观察与心率统计

培养至72 hpf时斑马鱼卵基本全部孵化，此时将培养液全部更换为正常养殖水，置于显微镜下观察并统计不同浓度实验组和对照组的死亡数。斑马鱼死亡标准参照OECD（No.212）指导原则为判断依据：以斑马鱼胚胎静止不动、心脏停止跳动、身体变白、不透明或半透明、对机械刺激无反应为依据判断为死亡。小心地逐个挑出存活的斑马鱼于盖玻片上，显微镜下观察并拍摄斑马鱼的心脏形态，同时计算其每分钟的心跳数。

2.3 实时荧光定量PCR

收集足够数量的（约50只）72 hpf的斑马鱼（对照组和给药组）于研钵中，加入液氮进行研磨，将斑马鱼组织磨碎后加入TRIzol进行裂解，然后加入氯仿涡旋后离心后得RNA沉淀，最后加入异丙醇与乙醇洗涤RNA沉淀，60℃孵育RNA沉淀使其溶解。测定RNA浓度后经两步法反转录成cDNA。根据各基因序列设计并合成引物，各基因序列如下：has2 F序列：GCTGCTCCAAGATGAGATGTG，R序列：CCCACAAGCAGTGAAATGCC；amhcF序列：ATTCAAGCTAACCCTGCGCT，R序列：GCTCGTCCCGAAATGAATGC；vmhcF序列：TGGTGCACATCAGACAAGGC，R 序 列：TGTCACCTTCACGACTGACG；hand2 F序列：GGCGAAAGAAGGAAATGAATGACG，R序列：TTCAGCTCCAATGCCCAAAC；gata5 F序列：CGCAAACCAAAGATGCCCAA，R序列：AACTGTGTCGATGCCTGTGT；cmlc2 F序列：CCAGAGGAAACCATCCTTGCT，R序列：TGGTCAACCTCTTCTGCTGTG；nkx2.5 F 序 列：TGCTTCAGGCTTTTACGCGA，R 序 列：TCCTGACAAAACCCGATGTCTTTTT；β-actin F序列：AATCCCAAAGCCAACAGA，R序列：GATACCGCAAGATTCCATAC。按照荧光定量PCR试剂盒说明书扩增PCR，记录CT值，以β-actin作为管家基因进行校准后，计算各实验组基因相对于对照组的相对表达量。

2.4 数据统计与分析

3 结 果

3.1 3种新型蛋白酶体抑制剂对斑马鱼死亡率的影响

图2是 3种化合物 NNU395、NNU458及NNU459及各自改构前体对斑马鱼致死率的量效曲线，可见5种化合物均浓度依赖性的增加了胚胎期斑马鱼的死亡率。图2-A可以看出50μmol／L NNU395还未能引起斑马鱼胚胎的死亡，但同浓度的carfilzomib对斑马鱼的致死率已大于15%。当NNU395浓度为100μmol／L时致死率小于10%，而同浓度的carfilzomib的致死率已大于50%。之后随着NNU395浓度升高致死率逐渐上升，浓度由150μmol／L增加到200μmol／L时，致死率上升的比较明显，而当浓度为250μmol／L时，每个实验组的斑马鱼在72 hpf时已全部死亡（图2-A）。同时经Hill方程拟合得到NNU395及其改构前体carfilzomib的 LC50分别为（179.7±12.2）和（91.9±17.0）μmol／L，NNU395的 LC50约是 carfilzomib的2倍，说明NNU395较之其改构前体carfilzomib具有更低的毒性。

图 2-B可以看出，浓度为 10μmol／L时，NNU458的致死率为0%，ixazomib和 NNU459的略高一些。浓度为20μmol／L时，NNU458和NNU459的致死率仍然不高（低于30%），而ixazomib的致死率已接近50%。但浓度达30μmol／L时3种化合物的致死率都有一个急剧的上升，而浓度升高至40μmol／L时，3种化合物的致死率都已接近100%。同时经Hill方程拟合得到3种化合物的LC50分别为（21.5±2.4）μmol／L（ixazomib），（27.5±1.3）μmol／L（NNU458）和 （24.4 ±2.6）μmol／L（NNU459）。该部分的结果显示，与前期电生理及大鼠体内实验结果一致（数据略），改构后的待测化合物NNU395，NNU458和NNU459较之各自前体都具有更低的毒性，接下来将继续考察3种待测化合物对斑马鱼的心脏毒性。

Figure 2 Effects of carfilzomib，NNU395，ixazomib，NNU458 and NNU459 on embryonic mortality in zebrafish（x¯±s，n=2 3）.Zebrafish embryos were treated with carfilzomib at the concentrations of 5，10，50，100，150，250 and 300μmol／L；NNU395 at the concentrations of 50，100，120，150，200，220 and 250μmol／L；ixazomib at the concentrations of5，10，20，30，40 and 50μmol／L；NNU458 and NNU459 at the concentrations of 10，20，30，40 and 50μmol／L from 6 hpf to 72 hpfA：Concentration-response curve for carfilzomib and NNU395 treatment；B：Concentration-response curves for ixazomib，NNU458 and NNU459 treatment.Two or three replicates of15 embryoswere used for each concentration assay

3.2 3种新型蛋白酶体抑制剂对斑马鱼心脏形态的影响

当斑马鱼胚胎发育至72 hpf时，对照组的斑马鱼发育正常，从卵中孵化出幼鱼，心脏形态无异常（图 3-A）。50μmol／L（图 3-B）和 100μmol／L（图3-C）的NNU395处理后，斑马鱼心脏形态也无明显异常，而当NNU395浓度增加至120μmol／L（图3-D）和150μmol／L（图3-E）时，斑马鱼心脏出现心包腔水肿和心脏畸形。当浓度继续升高达到200μmol／L，斑马鱼心脏出现更严重的畸形，包括心室变小、心包腔液体渗出和血流缓慢甚至无血液循环等形态学变化（图3-F）。

0.1、1和10μmol／L的NNU458组的斑马鱼心脏发育正常（图4-B～3-D），同对照组相比无明显变化（图4-A），30μmol／L的 NNU458组斑马鱼出现明显的心包腔水肿（图4-E）。0.1和1μmol／L NNU459处理后，斑马鱼心脏也无明显异常（图4-F和4-G）。10μmol／L NNU459组的斑马鱼出现轻微的心包水肿和心室变小（图4-H），30μmol／L NNU459组斑马鱼出现明显的心包水肿（图4-I）。

3.3 3种新型蛋白酶体抑制剂对斑马鱼心率的影响

如表1所示，未给药的对照组斑马鱼的平均心率为（158±3）min-1，与对照组相比，50和100μmol／L NNU395处理后的斑马鱼心率略有降低，但与对照相比差异无显著性。随着NNU395浓度升高，斑马鱼心率逐渐显著降低，200μmol／L NNU395处理后的斑马鱼平均心率只有（90±7）min-1（P＜0.05）。

Figure 3 Effect of NNU395 on cardiacmorphology in zebrafishZebrafish embryos were treated with different concentrations of NNU395 from 6 hpf to 72 hpf（Scale bar：400μm.Arrows point to pericardial edema or cardiacmalformation）A：Normal control；B，C，D，E and F：50，100，120，150 and 200μmol／L NNU395 groups，respectively

Figure4 Effects of NNU458 and NNU459 on cardiacmorphology in zebrafishZebrafish embryoswere treated with different concentrationsof NNU458 and NNU459 from 6 hpf to72 hpf（Scale bar：400μm.Arrows point to pericardial edema）A：Normal control；B，C，D，and E：0.1，1，10 and 30μmol／LNNU458 groups，respectively；F，G，H and I：0.1，1，10 and 30μmol／LNNU459 groups，respectively

Table 1 Effect of NNU395 on the heart rate of zebrafish at 72 hpf.Zebrafish embryoswere treated with different concentrations of NNU395 from 6 hpf to 72 hpf（±s，n=8）

Table 1 Effect of NNU395 on the heart rate of zebrafish at 72 hpf.Zebrafish embryoswere treated with different concentrations of NNU395 from 6 hpf to 72 hpf（±s，n=8）

***P＜0.001 vs NNU395 0μmol／L group

c（NNU395）／（μmol／L） Heart rate／min-1 158±3 50 155±6 100 153±7 120 139±11***150 129±15***200 90±7 0***

如表2所示，与对照组相比，0.1～30μmol／L的NNU458处理后，斑马鱼心率显著降低。0.1和1μmol／L NNU459组的斑马鱼心率无显著变化，而10～30μmol／L的NNU459处理后斑马鱼心率显著降低（P＜0.05）。

3.4 3种新型蛋白酶体抑制剂对斑马鱼心脏发育基因表达的影响

为了考察化合物对斑马鱼心脏发育相关基因表达的影响，基于3种待测化合物对斑马鱼的LC50，选取略低于各自LC50的一个浓度作为考察浓度，即 150μmol／L NNU395，20μmol／L NNU458或NNU459。检测基因包括：has2（心内膜特异性标记物，限制性存在于大约48 hpf的瓣膜形成区域），amhc（心房特异性表达基因），vmhc（心室前体细胞的标志），hand2（基本螺旋-环-螺旋转录因子，在侧板中胚层的心源性区域以及后来的心肌以及鳃弓中表达），gata5（在晚期囊胚阶段表达于内胚层祖细胞的转录因子，对于内胚层和心脏的发育是必需的），cmlc2（心房前体细胞和心室前体细胞的前体标记物），nkx2.5（心脏区域的标记基因，参与心脏环化，心肌细胞分化和增殖，心脏形态发生）［5］。图 5可以看出，150μmol／L NNU395，20μmol／L NNU458或NNU459对斑马鱼心脏发育相关的各基因的表达都无显著影响（P＞0.05）。

Table 2 Effects of NNU458 and NNU459 on the heart rate of zebrafish at72 hpf.zebrafish embryoswere treated with different concentrations of NNU458 or NNU459 from 6 hpf to 72 hpf（±s，n=8）

Table 2 Effects of NNU458 and NNU459 on the heart rate of zebrafish at72 hpf.zebrafish embryoswere treated with different concentrations of NNU458 or NNU459 from 6 hpf to 72 hpf（±s，n=8）

**P＜0.01，***P＜0.001 vs NNU458 and NNU459 0μmol／L group，respectively

c／（μmol／L） NNU458 Heart rate／min-1 NNU459 Heart rate／min-1 172±5 203±5 0.1 163±6** 204±5 1 164±6** 195±10 10 162±7** 171±5***20 158±10** 170±8***30 147±6*** 156±1 0***

Figure 5 Effects of NNU395，NNU458 and NNU459 on the expression of genes involved in heart development.Zebrafish embryoswere treated with 150μmol／LNNU395，20μmol／L NNU458 or NNU459 from 6 hpf to 72 hpf.The expression of genes was shown as fold change compared with untreated control groups after normalized toβ-actin.Five to seven replicates of50 embryos were used for each assay（±s，n=5 7）

4 讨 论

NNU395、NNU458和 NNU459是在已上市的抗肿瘤药物的结构基础上改构并全新合成的蛋白酶体抑制剂，蛋白酶体抑制剂的抗肿瘤原理主要是通过抑制蛋白酶体的活性，导致促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡的改变，包括肿瘤抑制蛋白的积累，从而造成细胞周期受阻和细胞凋亡［14］。然而，在心肌细胞中，蛋白酶体在维持胞内蛋白质稳态中起着重要的作用，对其的药理抑制很可能会影响正常的心脏功能［15-16］。事实上，在已上市的蛋白酶体抑制剂类抗肿瘤药物的使用过程中确实存在着心脏毒性的报道［12-13］。因此，评价 NNU395、NNU458和NNU459这3种新型蛋白酶体抑制剂的心脏毒性尤为必要。

目前，FDA批准的关于药物心脏安全性评价标准主要包括两个方面，一是以大鼠或犬类为动物模型研究药物对心血管系统产生的副作用，另一方面则是研究药物对HERG钾离子通道的阻断作用［17-18］。前期的电生理实验表明，3种化合物均呈浓度依赖性的抑制HERG通道的尾电流，但3种化合物对HERG通道的半数抑制浓度都高于各自改构前体（数据略），即心脏安全性更高，因此本研究主要考察了3种改构化合物对斑马鱼的心脏毒性。由于药物心脏毒性评价的传统动物模型具有耗时长、花费高等缺点，而斑马鱼被推荐为一种新型的哺乳动物心血管疾病及药物心脏毒性评价模型［19-20］，本研究选用斑马鱼作为动物模型，对待测化合物的心脏毒性进行初步评价。

本研究从 NNU395、NNU458和 NNU459对斑马鱼胚胎心脏形态和功能等方面的影响考察了化合物的心脏毒性。研究结果表明3种化合物均浓度依赖性地增加了斑马鱼的死亡率，但较之各自改构前体毒性更低。低于致死浓度的3种化合物对斑马鱼的心脏形态都没有明显的影响，但当化合物浓度高于致死浓度尤其是半数致死浓度LC50时，化合物致使斑马鱼心脏出现明显的心包水肿、心室变小、心包腔液体渗出和血流缓慢甚至无血液循环等形态学变化。3种化合物还不同程度的引起斑马鱼心脏的心率降低，心率是心功能的重要指标之一，有研究表明在人体中能引起QT间期延长的药物可引起斑马鱼心动过缓［21］，可见高浓度的3种待测化合物对斑马鱼具有心脏毒性。而本实验结果显示，能引起斑马鱼心脏形态改变或心率降低的NNU395的浓度（50μmol／L）远高于（大于10倍）其改构前体carfilzomib在临床使用过程中病人血浆的血浓峰值，间接说明了NNU395具有潜在的临床应用安全性。同时，能引起斑马鱼心脏形态改变的NNU458和NNU459的浓度也远高于其改构前体ixazomib临床应用时的cmax。但是，能引起斑马鱼心率显著降低的NNU458浓度（0.1μmol／L）在ixazomib的cmax内。考虑到斑马鱼的药代动力学过程虽然并不能完全模拟人体，但仍具有一定的参考价值，因此临床使用过程中应注意浓度的选择，并密切监察病人尤其是有心脏病史的病人的心血管功能。本研究同时发现，3种化合物对心脏发育相关基因的表达没有显著影响，说明化合物对斑马鱼心脏形态和心功能的影响可能与影响发育基因的表达无关，具体通过何种机制仍有待进一步研究。

致谢：南京大学模式动物研究所赵庆顺教授对斑马鱼的提供及相关实验技术给予指导。