一种新型PI3K抑制剂JN-65的抗肿瘤活性及其分子模拟机制研究

柯 珂，蒋雯丽，王 雨，朱景宇，金 坚

（江南大学药学院药物设计与分子药理学实验室，无锡214122）

恶性血液肿瘤（hematological malignancies，HMs）是由血液细胞恶性增殖引起的一大类血液疾病，主要包括白血病（leukemia）、淋巴瘤（lymphomas）以及多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）。HMs约占所有肿瘤疾病的9%，为第4大恶性肿瘤［1］。HMs的临床治疗目前仍以联合化疗为主，如免疫调节剂lenalidomid以及蛋白酶体抑制剂bortezomib等。这些治疗方案虽然取得了一定的效果，但是由于这类药物特异性缺失，现已出现明显的多药耐药问题以及严重的不良反应，因此新的治疗药物亟待开发［2］。研究表明，HMs扩散迅速且经常规避治疗，使得该类疾病难以治愈，复发率较高，因此防止血液肿瘤细胞的快速增殖成为该疾病治疗的一个重要手段。目前，HMs特异性靶点的确定及靶向治疗成为新的研究方向。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号通路因其对细胞的增殖、代谢、存活、抗凋亡的关键调控而备受关注［3］。大量研究表明，PI3K的过度激活与多种肿瘤（如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、恶性血液肿瘤等）的发生、发展和预后密切相关，因此PI3K逐渐发展成为抗肿瘤领域的一个重要靶点［4-9］。PI3K具有丝氨酸／苏氨酸（Ser／Thr）激酶特性，同时还具有磷脂酰肌醇激酶的活性。根据结构和底物特异性，PI3K主要分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类，其中Ⅰ类PI3K因其在肿瘤中的重要作用而受到最广泛的研究［10-11］。Ⅰ类PI3K又分为ⅠA和ⅠB两个亚类，其中ⅠA类主要由受体酪氨酸激活，基于催化亚基的不同又分为PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ3个亚型；ⅠB类即为PI3Kγ亚型，由G蛋白偶联受体（GPCRs）激活［12］。激活的 PI3K将 PI（4，5）P2转化为 PI（3，4，5）P3，从而募集 PDK1、Akt等分子并使之磷酸化，将活化信号向下传递，从而影响细胞的生长、分裂、增殖和存活［13］。

在多种恶性血液肿瘤中，如T-细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）、急性髓系白血病（AML）、多发性骨髓瘤（MM）中，PI3K信号通路往往呈现过度表达的紊乱状态，因此开发PI3K抑制剂治疗恶性血液肿瘤具有广阔的应用前景［14-16］。第一个成功上市的 PI3K抑制剂为 idelalisib（CAL-101），于2014年被FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）和小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）［17］。随后，duvelisib（IPI-145）也于2018年成功上市，主要用于治疗复发性或难治性滤泡性淋巴瘤［18］。因此本研究拟通过对本课题组前期工作得到的82个潜在PI3K抑制剂进行抗恶性血液肿瘤活性研究，并采用计算机模拟的方法在分子水平研究活性化合物JN-65与PI3K的结合机制。

1 材 料

1.1 试 剂

82个化合物购自美国ChemBridge公司；阳性药PI-103（美国Selleck Chemicals公司）；MTT粉末（美国 Sigma公司）；Annexin V-凋亡检测试剂盒（美国BD公司）；SDS-PAGE上样缓冲液、蛋白裂解液（上海碧云天生物技术公司）；ADP-Glo发光检测试剂盒（美国 Promega公司，试剂盒含有PI3Kα、β、δ、γ及 PIP2底物蛋白）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（中国Biosharp公司）；ECL发光液（上海Tanon公司）；RPMI-1640培养基、IMDM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；抗体Phospho-Akt Ser473、抗体 Total-Akt（上海 Abacm公司）；抗体GAPDH（美国 Proteintech公司）。7-（1-甲基-1H-吡咯并［2，3-b］吡啶-4-基）-1（2H）-异喹啉酮（JN-65，美国ChemBridge公司）。

1.2 细胞株

白血病细胞（HL-60、U937、K562、Jurkat），多发性骨髓瘤细胞（OCI-My5、KMS11、U266）均购自ATCC细胞库。

1.3 仪器及计算软件

T7500高性能计算工作站（美国戴尔公司）；Dsicovery Studio 3.5（美国Biovia公司）；PyMOL（美国DeLano Scientific LLC公司），Prism分析软件（美国GraphPad Software公司）；凝胶成像仪（上海Tanon公司）；Infinite 200 PRO酶标仪（中国Tecan公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

2 方 法

2.1 细胞筛选模型建立

将白血病细胞（HL-60、U937、K562、Jurkat）和多发性骨髓瘤细胞（OCI-My5、KMS11、U266）复苏后，分别加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基和含有10%胎牛血清的IMDM培养基，将细胞置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。当细胞的生长密度达到70%～80%时，收集后于1 000 r／min离心5 min后重悬传代培养。

2.2 MTT方法测定化合物抑制细胞增殖

取细胞状态良好的恶性血液肿瘤细胞U937以密度为每毫升8×104个细胞接种于96孔板，每孔共95μL。将82个化合物溶液用培养基释至10μmol／L分别以每孔5μL加入含细胞的96孔板中，后放入培养箱中孵育72 h。培养结束后，每孔加入5 mg／mLMTT溶液10μL，继续孵育4 h。随后每孔加入DMSO 100μL，培养箱中孵育过夜。最后在波长为490 nm处，用酶标仪检测吸收度。

2.3 JN-65抑制多种恶性血液肿瘤细胞的增殖

取细胞状态良好的多种恶性血液肿瘤细胞，其中包括白血病细胞（HL-60／U937／K562／Jurkat）和多发性骨髓瘤细胞（OCI-My5／KMS11／U266）。计数稀释后，每种细胞以密度为每毫升8×104个细胞接种于96孔板，每孔共95μL。采用倍稀法稀释JN-65浓度（0～25μmol／L），分别将药物 5μL加入到细胞孔板中，放入培养箱中，分别孵育24、48和72 h。培养结束后，每孔加入5 mg／mL MTT溶液10μL，继续孵育4 h。随后每孔加入DMSO 100μL，培养箱中孵育过夜。最后在波长为490 nm处，用酶标仪检测吸收度。

2.4 体外酶活性实验检测JN-65的PI3K抑制活性

使用ADP-Glo试剂盒检测JN-65的PI3K抑制活性：首先设置JN-65终浓度为20μmol／L，采用倍稀法稀释JN-65浓度，设置10个浓度梯度（0～20μmol／L）。按照ADP-Glo试剂盒说明书分别配制PI3Kα、β、δ、γ酶反应溶液，每孔2μL，随后每孔加入JN-65 0.5μL，最后加入PI3K底物蛋白PIP2 2μL，空白组加入相应量的DMSO，所有溶液配制于384孔白板中并设置3个复孔；第二步加入ATP溶液0.5μL启动反应，室温孵育45 min；随后加入ADP-Glo检测溶液5μL，室温孵育40 min后加入激酶检测缓冲液10μL，23℃孵育50 min；最后，利用酶标仪检测荧光信号强度，使用Prism拟合IC50。

2.5 免疫印迹法检测JN-65抑制PI3K／Akt信号通路

将白血病细胞Jurkat培养于细胞培养瓶中，待细胞密度为80%，收集离心处理后，计数稀释至密度为每毫升2×106个细胞接种于6孔板，每孔共2 mL。JN-65浓度为：0，2.5，5，10，20μmol／L。共同孵育24 h后，离心收集并用4℃PBS重悬吹洗细胞两次。弃上清液加入细胞裂解液100μL，放置于冰上超声破碎，随后4℃静置反应20min。最后使用4℃离心机，12 000 r／min，离心 20 min。

离心后取上清液，用BCA蛋白浓度测试试剂盒测定蛋白浓度，取总蛋白30μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。上层浓缩选取80 V电泳0.5 h，下层分离胶选取100 V电泳1 h，转膜选取100 V电压运行1 h，5%脱脂奶粉封闭90 min，一抗孵育（Phospho-AKTSer473，GAPDH），4℃过夜，TBST洗膜4次，每次10 min，二抗孵育60 min，TBST洗膜4次，每次10 min。最后利用ECL发光显影液，将NC膜放置于凝胶成像仪中发光成像。

2.6 细胞流式法检测JN-65对白血病细胞的促凋亡作用

将白血病细胞Jurkat培养于细胞培养瓶中，待细胞密度为80%，收集离心处理后，计数稀释至密度为每毫升1×105个细胞接种于12孔板，每孔共1 mL。JN-65以浓度梯度：0，2.5，5，10，20μmol／L分别作用24 h。先加入Annexin V Binding Buffer 100μL重悬细胞，再依次加入Annexin V-FITC溶液5μL和PI溶液5μL，避光反应10min。打开流式细胞仪，准备上样时，每个样品加入结合缓冲液200μL终止反应并重悬细胞，开始检测。

2.7 计算机模拟JN-65与Ⅰ类PI3K相互作用

从PDB数据库中选择分辨率最高的含有抑制剂配体的 PI3K晶体结构：PI3Kα（5XSC）［19］、PI3Kβ（2Y3A）［20］、PI3Kδ（4XEO）［21］、PI3Kγ（4KZC）［22］。使用 DS 3.5绘制 JN-65，并通过 Ligand Preparation模块基于CHARMm力场对其进行优化。使用DS 3.5软件中的Protein Preparation模块对4个蛋白进行预处理，包括：删除所有存在的结晶水分子、修正键级、添加氢原子、基于CHARMm力场分配局部电荷、分配质子化状态、优化体系的结构并在RMSD达到0.3Å时停止优化。通过Define and Find Binding Site模块，以蛋白晶体结构原有小分子抑制剂配体作为参照中心，生成活性口袋格点用于对接。采用CDOCKER模块将JN-65分别对接到4个亚型中，保留对接结果最好的复合物进行分析，其余参数均为默认值。

3 结 果

3.1 JN-65对血液肿瘤细胞的毒性作用

为了寻找能够特异性抑制恶性血液肿瘤的PI3K抑制剂，本研究首先使用U937白血病细胞对前期得到的82个化合物进行细胞水平初筛。初筛药物浓度为10μmol／L，作用时间为72 h，最后使用MTT法分析细胞的存活率，进而检测化合物对细胞的抗增殖作用，结果见图1。从图中可见，部分化合物对U937具有一定的抑制活性（对U937细胞抑制率在70%以下）。以抑制率70%为阈值，可以发现JN-65（结构见图1）对U937表现出较强的毒性作用，表明JN-65具有较强的抗白血病细胞的增殖作用。

3.2 JN-65有效抑制恶性肿瘤细胞的增殖

为了进一步证实JN-65对血液肿瘤细胞的抑制作用，将JN-65作用于多种血液肿瘤细胞系。采用倍稀法将 JN-65按照一定浓度梯度（0～25μmol／L）作用于多种细胞，包括白血病细胞（HL-60／U937／K562／Jurkat）和多发性骨髓瘤细胞（OCI-My5／KMS11／U266），同时孵育不同时间（24，48，72 h），结果如图 2。图 2A、2B、2C表明，随着JN-65作用浓度和作用时间的增加，细胞的增殖均呈现逐渐下降的趋势，对部分细胞表现出了较强的抑制作用，包括HL-60、U937、Jurkat白血病细胞，表明了JN-65可能对白血病细胞具有更强的抑制作用。随着 JN-65作用浓度的升高（图 2-D），Jurkat细胞的增殖生长受到极强的抑制，仅在24 h作用后细胞存活率就低于50%：作用24 h的JN-65的 IC50为8.33μmol／L；作用 48 h的 JN-65的 IC50为4.68μmol／L；作用72 h的 JN-65的 IC50为3.12 μmol／L；对 U937作用 72 h的 JN-65的 IC50为10.46μmol／L。因此JN-65能高效抑制恶性血液肿瘤细胞，尤其是白血病细胞的增殖和生长，并且这种抑制呈现一定的剂量与时间依赖关系。

Figure 1 MTT methods for screening the active inhibitor and the chemical structure of JN-65JN-65：7-（1-Methyl-1H-pyrrolo［2，3-b］pyridin-4-yl）isoquinolin-1（2H）-one

Figure 2 JN-65 effectively inhibits the proliferation ofmalignant tumor cells.Various hematologic malignancies cells were treated with different concentrations of JN-65 for（A）24 h；（B）48 h；（C）72 h；（D）Jurkat cellswere treated with different times and concentrations of JN-65（±s，n=3）

3.3 JN-65抑制PI3K功能并有效抑制PI3K信号通路

以上实验结果表明了在细胞水平JN-65对多种恶性血液肿瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用，为了进一步验证JN-65对PI3K的抑制效果，采用ADP-Glo发光试剂盒进行体外PI3K激酶检测。结果表明，JN-65对PI3K具有一定的抑制活性，IC50分别为：PI3Kα＞20μmol／L；PI3Kβ=（15.24±1.02）μmol／L；PI3Kδ=（18.24±1.43）μmol／L；PI3Kγ=（10.13±0.92）μmol／L。由此可见 JN-65对PI3K具有一定的抑制活性，其中对PI3Kγ的抑制活性较高，表现出一定的PI3K亚型选择性抑制效果。为了进一步检测JN-65在蛋白水平对PI3K信号通路的抑制作用，采用Western blot方法检测在不同浓度的JN-65作用下PI3K信号通路关键蛋白Akt磷酸化（p-AktSer473）水平，分析活性化合物对PI3K／Akt信号通路相关因子的影响，进一步揭示候选化合物抑制白血病细胞的作用机制。选用Jurkat细胞作为实验对象，结果见图3，结果表明随着化合物作用浓度的加大，p-Akt表达受到的抑制作用增强，同时化合物对total-Akt没有明显抑制作用。在Jurkat细胞中，JN-65表现出比阳性化合物更强的抑制效果，且这种抑制效果也呈现出一定的浓度依赖关系。证明了在蛋白水平JN-65确实能够有效地抑制PI3K的表达。

Figure 3 JN-65 inhibits the expression of PI3K／Akt signaling pathway

3.4 JN-65有效促进恶性血液肿瘤细胞的凋亡

上述实验证明了JN-65对PI3K具有明显的抑制作用，为了进一步观察化合物对肿瘤细胞的促凋亡作用，运用流式细胞术来检测化合物对肿瘤细胞的促凋亡作用。以Jurkat细胞作为实验对象，将候选化合物作用于Jurkat细胞株孵育24 h后，经Annexin V-FITC和碘化乙啶（PI）染色，用流式细胞仪分析Annexin V细胞的阳性率，分析Jurkat细胞的凋亡情况，结果见图4。可以看出随着JN-65作用浓度的增大，细胞出现了显著的凋亡。当JN-65作用浓度为10μmol／L时，有超过一半的Jurkat肿瘤细胞发生凋亡，并在20μmol／L发生凋亡的细胞已高达74.1%。这表明JN-65能有效促进肿瘤细胞发生凋亡。

Figure 4 JN-65 induces the apoptosis of malignant hematological tumor cells

3.5 JN-65与PI3K活性口袋相互作用分析

上述生物学活性实验已经表明JN-65能通过抑制PI3K／Akt信号通路进而诱导恶性血液肿瘤细胞发生凋亡从而抑制肿瘤细胞的增殖，为了在分子水平深入研究JN-65与Ⅰ类PI3K的相互作用关系，通过分子对接技术将JN-65分别对接到4个PI3K亚型蛋白中，对接得分结果分别为PI3Kα=-5.60 kcal／mol、PI3Kβ=-10.23 kcal／mol、PI3Kδ=-6.18 kcal／mol、PI3Kγ=-11.40 kcal／mol。对接结果表明，JN-65与PI3Kγ的结合作用最强，显著高于对PI3Kα及PI3Kδ的结合强度，该模拟结果也符合上述体外酶活性结果。对接结果如图5所示，图5A显示PI3Kα活性口袋内有一个残基Lys656与JN-65的吡咯环形成π-H键，对比PI3Kα活性结合口袋，JN-65的吡咯环也与 PI3Kδ的残基Met752形成了π-H键（图5C）。除此之外，JN-65异喹啉酮上的酮基与PI3Kδ的残基Val828形成了氢键，这增强了JN-65与PI3Kδ的相互作用。观察图5B，在PI3Kβ活性结合口袋内，JN-65周围有大量氨基酸，并且JN-65的吡啶环与Val847形成了π-H键，除此之外与残基Val848通过氢键形成较强的相互作用。此外，JN-65异喹啉酮上的吡啶N与PI3Kβ的氨基酸Asp807形成氢键，酮基和氨基酸Tyr833形成氢键相互作用，这些氢键作用帮助JN-65稳定在PI3Kβ的活性口袋内，极大地改善了JN-65与PI3Kβ的结合亲和力。分析PI3Kγ活性口袋（图5D），发现JN-65围绕着更多的非极性氨基酸，如 Phe961、Ile831、Trp812和 Lys833，这些氨基酸将 JN-65紧紧包围在 PI3Kγ活性口袋内。PI3Kγ的残基Ala885和Ile879均和JN-65形成了π-H相互作用，尤其是氨基酸Val882与异喹啉酮上的吡啶N和酮基均形成了氢键相互作用。有趣的是，这些关键性氨基酸都是非极性氨基酸，因此非极性作用是JN-65与PI3K结合的关键作用。通过对比4个亚型在吡咯并吡啶环上和异喹啉酮上的吡啶环上与JN-65形成的π-H相互作用，研究发现在异喹啉酮的吡啶环上形成的π-H相互作用对JN-65结合PI3K活性口袋具有重要影响，这意味着异喹啉酮的吡啶环对JN-65与PI3K的亲和力起到关键作用，为后期化合物结构改造提供了一定的理论基础。

Figure5 Presentation of JN-65 interacting with four isoforms of PI3Ks by 2D（left）and 3D（right）A：PI3Kα；B：PI3Kβ；C：PI3Kδ；D：PI3Kγ

4 讨 论

在对82个化合物细胞筛选实验中，化合物JN-65的抗肿瘤活性效果突出。随后对包括白血病细胞和多发性骨髓瘤细胞在内的多种恶性血液肿瘤细胞的增殖抑制作用检测结果表明，JN-65能有效抑制恶性血液肿瘤细胞的生长和增殖，尤其是对白血病细胞抑制效果更强，其IC50最高可达3.125 μmol／L，并且其抑制作用呈现出浓度和时间依赖性。通过体外酶实验发现JN-65对PI3K具有显著的抑制作用，且对PI3Kγ表现出一定的选择性抑制作用。大量研究表明了PI3Kγ主要表达于白血球中，对PI3Kγ的选择性抑制往往有助于恶性血液肿瘤的治疗［1］，上述细胞实验表明JN-65对白血病细胞具有特异性抗增殖作用，因此推测这种特异性作用来源于JN-65对PI3Kγ的选择性抑制。免疫印迹实验结果证明，JN-65在蛋白水平能有效地抑制PI3K，进而阻滞p-Akt表达，最后通过这种抑制作用显著地诱导肿瘤细胞凋亡。上述生物学实验表明，JN-65可能成为一种潜在的PI3K抑制剂，用于治疗恶性血液肿瘤。随后，通过分子对接方法深入研究了JN-65与PI3K 4种亚型的结合机制，分子对接得分与上述酶实验结果较为吻合，JN-65与PI3Kγ表现出较强的结合能力。通过构象关系研究发现非极性作用是JN-65与PI3K结合的关键作用，且异喹啉酮的吡啶环作为JN-65的结构特征，对保持JN-65与PI3K的高亲和性具有重要作用，为后期化合物设计及改造提供了一定的理论基础。