细胞器互作分子机制及其在疾病发生发展中的作用

2019-08-28黄淑贞王广基

中国药科大学学报 2019年4期

黄淑贞，王广基，谢媛

（中国药科大学药物代谢动力学重点实验室，南京210009）

具有特定形态和功能的膜性结构细胞器是真核细胞执行生命活动的功能区域。每种细胞器均有其特定的功能，但同时它们之间发生相互作用，通过相互协调来完成一系列重要生理功能。细胞器的精细分工、相互协作和密切接触，形成细胞器互作网络，实现快速的物质交换和信息交流，执行不同条件下细胞生命活动的多种生物学过程。细胞器互作网络的紊乱与多种疾病的发生发展密切相关。例如，内质网（ER）作为真核细胞中最大的膜系统，由多个相互连接且相邻的结构域组成［1］。内质网具有多种必需的生理功能，包括蛋白质合成和加工、脂质合成以及Ca2+的储存和释放［1］。长期以来认为囊泡运输是内质网与其他细胞器相联系的主要机制，但最近的研究表明内质网膜与线粒体、质膜（PM）、高尔基体紧密连接并促进脂质的转移以及介导信号的功能，这种与其他细胞器形成的微小的膜连接称之为膜接触位点（MCSs）。细胞器膜接触位点的存在表明，定位于两个不同细胞器的因子可以聚集在一起，协同参与细胞器的附加功能。因此，本文重点介绍内质网与3种不同的胞质细胞器：质膜、线粒体和高尔基体的MCSs中已发现的结构和功能，探讨其在生命学科以及药学领域中的相关研究进展。

1 内质网与质膜（ER-PM）的相互作用

通过电子显微镜首次观察到内质网与质膜之间存在紧密的接触，这种接触不是简单的膜的融合，而是分别位于内质网膜和质膜上的特殊蛋白之间的交互作用。两者在连接处的间隙距离在10～30 nm，间隙距离太窄而不能适应核糖体的存在。目前已知的位于质膜的连接位点有瞬时受体电位通道（TRPC）、钠-钙交换体（NCX），以及直接跨越ER和 PM的亲联蛋白（JP）和 Nir2［2-4］等，在这些连接位点中发生着许多重要的生理活动，例如脂质转运以及Ca2+稳态的维持等。

1.1 ER-PM间Ca2+转移机制及其在心血管疾病和肿瘤发病中的意义

质膜作为防止胞外Ca2+进入胞内的重要屏障，ER-PM连接在Ca2+信号转移中发挥重要作用，而ER-PM连接的形成同样需要Ca2+的调控。

基质相互作用分子（STIM）蛋白在细胞中起着Ca2+信号的动态协调作用。随着ER释放Ca2+，STIM蛋白发生复杂的活化反应并迅速移位到ERPM连接区域。在那里，STIM蛋白激活Orai通道，介导控制Ca2+信号和平衡胞内Ca2+的稳态［3］。在此过程中，钙池操纵钙内流（SOCE）被激活，其中瞬时受体电位通道1（TRPC1）被鉴定为SOCE的分子组分。TRPC介导的钙库操纵性电流与Orai1介导的钙释放激活钙电流（ICRAC）不同，因此两者可以形成TRPC-Orai1复合物调节Ca2+信号。

SOCE主要是非兴奋性细胞中的钙通道，而在兴奋细胞中起作用的是二氢吡啶受体（DHPR）-位于PM上的电压门控型Ca2+通道（VGCC）和位于ER上的RyRs，两者在磷脂酰肌醇和JP的作用下介导平滑肌细胞收缩。收缩期间，DHPR首先通过膜去极化激活以介导Ca2+内流，随后ER-PM连接处局部Ca2+水平的增加开放RyR，导致SR Ca2+释放和胞质Ca2+水平进一步增加，从而引发肌肉收缩［5］。

除上述蛋白，ER-PM连接处还存在例如NCX，它与TRPC3和IP3R1形成NCX1-TRPC3-IP3R1复合物参与TNF-α诱导的Ca2+失衡和细胞凋亡，进一步研究发现乙酰胆碱可以通过激活M3AChR／AMPK途径阻止NCX1-TRPC3-IP3R1复合物的形成［5］。此外，还观察到平滑肌细胞中NCX1与ER上的SERCA2分布的重叠，通过抑制SERCA的活化，NCX介导的Ca2+内流降低，避免了由于Ca2+超载引起的细胞损伤［6］。

Ca2+的稳态在心血管疾病发生过程中至关重要，用于治疗心血管疾病的钙通道阻滞药主要就是通过选择性的阻滞PM上的Ca2+内流，从而减少胞内Ca2+的蓄积［7］。其中 STIM-Orai介导的 SOCE与响应病理刺激的心脏和血管重塑密切相关［8］。另外，NCX1和TRPC6的上调参与了多种原发性高血压模型中高血压的发病机制［9］。除此之外，越来越多的证据暗示了肿瘤发生发展中STIM-Orai信号传导的作用，STIM1依赖性Ca2+信号传导可以整合肌动蛋白和黏着斑之间的动态相互作用，以介导有效的肿瘤细胞迁移，靶向SOCE、STIM1和Orai1的分子组分是抑制肿瘤细胞迁移和肿瘤转移的有前景的方法［10］。

1.2 ER-PM间脂质转运与脂质紊乱疾病的关系

控制ER-PM连接的PM磷脂水平可以通过一些参与连接的LTP来控制。例如，在PM中与磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）结合的氧固醇结合蛋白（OSBP）相关蛋白5（ORP5）和 ORP8，也通过与 ER定位的Sac1磷酸酶接触来控制膜中的PI4P浓度并选择性富集PM中的磷酯酰丝氨酸（PS）［11-12］。Nir2和 Nir3，其与 PM的结合涉及 PI（4，5）P2代谢物磷脂酸（PA），介导PA从PM到ER的转运以及磷脂酰肌醇（PI）从ER到PM的转运，从而提供PM中PI（4，5）P2产生所需的 PI［13］。这些相互关系意味着在膜接触位点发生脂质运输的反馈机制，而脂质运输的紊乱会引起多种疾病的发生，例如体内脂质平衡的改变会影响脊髓灰质炎病毒多蛋白的蛋白水解加工，这一过程依赖于宿主因子：磷脂酰肌醇-4-激酶Ⅲβ（PI4KB）和 OSBP用于基因组复制［14］。

2 内质网-线粒体（MAM）的相互作用

通过荧光显微镜和电子显微镜可以观察到内质网和线粒体在多个接触位点连接在一起形成特定区域，称为线粒体-内质网相关膜（mitochondriaassociated membrane，MAM）。然而，虽然内质网和线粒体膜形成特定的接触位点，但它们不融合，维持细胞器的不同结构，保持其功能和特性。

MAM是对细胞生理条件十分敏感的一种高度可变的动态结构，其在动态过程中保持正常的形态结构依赖于某些作为物理连接的蛋白质分子，主要包括钙离子通道IP3受体（IP3R）、分子伴侣葡萄糖调节蛋白75（Grp75）、内质网-线粒体相遇结构复合体（endoplasmic reticulum mitochondria encounter structure，ERMES）以及线粒体融合蛋白 2（MFN2）等。此外，MAM内还含有其他多种蛋白，与协调Ca2+转移、ROS的产生、凋亡诱导以及脂质代谢相关。例如与内质网-线粒体间 Ca2+转移相关的VDACs、PTEN、Sig-1R、mTORC2及 calnexin；与 ROS的生成相关的 p66shc、Ero1-La、Ero1-Lb，其中 Ero1-La还与ER的IP3R相互作用调节内质网-线粒体间Ca2+的转移，影响凋亡的诱导；而定位于MAM的Ltc1和脂质代谢调节相关。

2.1 MAM中Ca2+转移机制及其在疾病发生中的作用

肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）受体（IP3R）是位于ER上的IP3激活的Ca2+释放通道，通过MAM控制Ca2+从 ER向线粒体转移［15］。与此相对的VDAC1，其通过MAM上的分子伴侣葡萄糖调节蛋白75（GRP75）与IP3R相互作用，且GRP75沉默会消除IP3R和VDAC1之间的功能性偶联，从而减少线粒体Ca2+摄取［16］。此外，包括张力蛋白同系物（PTEN）［17］、早幼粒细胞白血病蛋白（PML）［18］、p53［19］等定位于ER或MAM的抑癌基因和肿瘤抑制因子通过与IP3Rs以及Akt相互作用，调节Ca2+稳态，负调节或正调节细胞凋亡。临床上有不少抗肿瘤药的作用基于此机制，例如三氧化二砷通过增加MAM的PML水平，恢复了肿瘤细胞中IP3R介导的内质网-线粒体 Ca2+转移，抑制自噬［20］；阿霉素通过在SERCA泵中富集p53使Ca2+转移更有效，导致SERCA活性增加，ER Ca2+水平增加和致敏细胞凋亡［19］。

此外，calnexin也是影响病理状态下Ca2+稳态的重要因素。Calnexin是一种内质网凝集素，介导粗面内质网上的蛋白质折叠。Calnexin与细胞质分选蛋白PACS-2相互作用将calnexin分布于ER，MAM和质膜之间，其中超过80%的calnexin定位于ER，其中大部分位于MAM，而PACS-2敲除导致calnexin从ER向质膜再分布，从而影响线粒体和ER Ca2+稳态［21］。和 PACS-2敲除细胞一样，Mfn2敲除同样引起 Ca2+转移，Brito等［22］认为当 Mfn2缺失时，细胞器间的距离增大，钙摄取功能受损；而Mfn2过表达则会使细胞器间连接更紧密，有助于钙传递并诱发凋亡［23］。Filadi等［24］研究显示在 Mfn2敲除细胞显示增加的内质网-线粒体密切接触的数量，增强的细胞器间Ca2+转移以及对细胞死亡刺激的更高的敏感性。当与钙蛋白酶抑制剂共存时，Mfn2可能在保护神经肌肉突触中发挥作用，并作为骨骼肌萎缩的常见治疗靶点。Mfn2在多种生理过程中均发挥重要作用，Filadi等［24］描述了其在神经退行性疾病、心肌病、肥胖、糖尿病和肿瘤等疾病的发病机制，很有希望成为这些疾病治疗的潜在靶点。

此外，还有一些与Ca2+转移相关的蛋白，如Sigma 1受体（Sig1R）在MAM处富集，通过与IP3R相互作用调节ER和线粒体之间的Ca2+交换，充当细胞间信号调节剂［25］，在阿尔茨海默病（AD）的病理生理学中占据突出地位，是开发新的疾病修饰治疗策略的目标［26］。精神分裂症破坏蛋白 1（DISC1）是一种支架蛋白，与认知和情绪缺陷有关，其定位于MAM，与IP3R1相互作用并调节其配体结合，调节Ca2+转移。由DISC1功能障碍引起的Ca2+转运的调节紊乱导致氧化应激后线粒体中的Ca2+异常积累，其损害线粒体功能［27］。

2.2 MAM中脂质交换异常与疾病的关系

除了调节Ca2+转移，MAM另外一个重要功能是细胞器之间的磷脂交换。磷脂酰丝氨酸（PS）通过MAM被转移到线粒体中，通过PS脱羧酶脱羧成磷脂酰乙醇胺（PE）（PS转移由ORP5和ORP8介导，其也定位于MAM）PE也通过溶血-PE酰基转移酶酰化溶血-PE在MAM上产生。最后，PE返回到ER，其中PEN-甲基转移酶甲基化它以合成磷脂酰胆碱（PC）［28］，ORP5／ORP8的缺失会引发磷脂交换的异常，导致线粒体形态的缺陷。Caveolin 1最近在MAM界面被发现，它调节内质网-线粒体胆固醇转移［28］，caveolin 1突变会导致脂肪代谢障碍，表现出脂肪组织的逐渐减少和胰岛素抵抗，与Berardinelli-Seip先天性脂肪代谢障碍（BSCL）疾病密切相关［29］。ERMES同样具有磷脂转运的功能，Murley等［30］鉴定出一个保守的非特征性 ER蛋白Ylr072w作为ERMES相互作用蛋白，其选择性地转运甾醇并因此被称为Ltc1，在线粒体中，在缺乏Mdm34（ERMES亚基）的情况下，Ltc1对于细胞活力是必需的。

2.3 MAM中活性氧（ROS）水平变化与疾病发生发展的关系

ROS是氧化损伤诱导剂，它涉及调节特定的细胞功能，包括细胞凋亡。p66Shc是一种位于MAM的氧化还原酶，能够产生线粒体ROS作为细胞凋亡的信号分子。p66Shc与细胞色素c相互作用并将电子从细胞色素 c转移至分子氧，导致H2O2形成［31］。p66Shc缺失已被证明可以减少缺血／再灌注（I／R）损伤以及与糖尿病和衰老相关的血管异常，p66Shc诱导的ROS形成也参与胰岛素信号传导，并且可能有助于针对轻度I／R损伤的自身内源性防御［32］。另外，研究发现天然抗氧化剂鼠尾草酸能通过SIRT1／p66Shc介导的线粒体途径减弱急性乙醇诱导的肝损伤［33］。此外，Ero1α也是蛋白质折叠和ER氧化还原平衡的关键控制者，它在MAM中的定位超过75%（定位取决于氧化条件）［34-35］。研究发现同型半胱氨酸（Hcy）可诱导Ero1α表达，增加的Ero1α活性产生过量的H2O2并导致ER中的蛋白质过度氧化，阐明了靶向ER氧化还原稳态作为内皮功能障碍相关血管疾病（包括动脉硬化、高血压、中风和I／R损伤）干预的可能性［36］。此外，Ero1-La和 ERp44（一种存在于MAM的ER管腔伴侣蛋白）相互作用，调节通过IP3R1从 ER释放的 Ca2+，进而影响细胞凋亡［34，37］。增加的Ero1α表达与肿瘤的过度增殖有关，抑制Ero1α的表达来抑制肿瘤细胞增殖可能是一条新的途径，同时心脏病的发展也可能以Ero1α表达的增加为特征。

2.4 线粒体分裂与自噬及其与疾病的关系

线粒体分裂的调节对于正常的细胞功能至关重要。线粒体分裂的中心参与者是高度保守的dynamin相关蛋白（哺乳动物中的Drp1，酵母中的Dnm1）［38］。Chakrabarti等［39］表明 INF2介导的肌动蛋白在ER上的聚合通过两种独立的机制刺激线粒体分裂：（1）线粒体钙摄取，导致IMM收缩和（2）Drp1寡聚化，导致OMM收缩。此外，线粒体钙单向转运体（MCU）也参与线粒体分裂，缺少MCU的细胞中裂变事件减少了60%［39］。研究还发现一种新型的 MAM蛋白-线粒体外膜蛋白FUNDC1，通过与缺氧条件下的ER驻地蛋白calnexin相互作用而在MAM中富集，并随着线粒体自噬的进行，它与 calnexin分离并优先募集DNM1L／DRP1以驱动线粒体分裂以响应缺氧应激。此外，在缺氧细胞中敲除FUNDC1，DNM1L或calnexin可增加细长线粒体的数量，并减少自噬体和线粒体的共定位，从而防止线粒体自噬［40］。与自噬有关的蛋白还有Lpg1137，其靶向MAM并降解syntaxin17——一种可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白，其通过与Drp1相互作用参与线粒体动态调节，而syntaxin17的降解阻断了自噬和BAX诱导的凋亡［41］。

过量线粒体裂变被认为是心肌再灌注损伤发病机制的主要致病因素，可能通过Drp1募集和收缩加剧心脏I／R损伤。同样MCU的活性也是I／R损伤诱导的线粒体异常和心肌细胞损伤的高度原因，提示MCU抑制可作为潜在治疗策略［42］。此外，涉及神经变性疾病、心血管疾病、肿瘤等疾病的发生均与过度的线粒体分裂相关［43］，而自噬已成为免疫介导疾病（包括自体炎症和自身免疫性疾病、感染和肿瘤）发病机制中的一个重要角色［44］。

3 内质网与高尔基体（ER-Golgi intermediate com partment，ERGIC）的相互作用

在高等真核生物中，高尔基体（GA）代表沿分泌途径的中央分选和加工站，确保在ER中合成的货物蛋白被适当修饰，并最终导向其目的地。

3.1 ERGIC中蛋白质分选异常机制及其和疾病的关系

外壳蛋白复合体Ⅱ（COPII）介导ERGIC分泌性蛋白质运输的初始步骤，COPII包被的囊泡将货物蛋白从ER转运到高尔基体，其中Sec24作为货物适配器包含多个货物结合位点以驱动捕获多种货物蛋白，这些货物蛋白的分选通过受体介导的运输发生，例如Erv14信号，其增强Sec24与货物蛋白的内源分选信号之间的相互作用。而COPI介导从高尔基到内质网和高尔基隔室之间的逆向运输，主要负责回收、转运内质网逃逸蛋白（escaped proteins）返回内质网［45］。ER-Golgi界面蛋白质分选质量控制的缺陷是许多错误折叠疾病的核心，其中与COPII相互作用的激活转录因子-6（ATF6）可以感知ER上错误折叠蛋白的积累，引发的内质网应激是肿瘤、糖尿病和神经退行性疾病，例如AD、帕金森病（PD）等疾病的重要发病机制［46-47］，也是这些疾病的重要治疗靶点之一。

3.2 ERGIC中脂质转运相关病理机制

ER和Golgi之间的膜接触位点包含以下脂质转运蛋白：CERT，其以非囊泡方式介导神经酰胺的细胞内运输［48］。FAPP2，一种葡萄糖神经酰胺转移蛋白，在复合鞘糖脂，质膜的关键结构和信号组分中的合成中具有关键作用［49］。Sec14／Nir2，一种PI转运蛋白，参与调节高尔基复合体中的DAG稳态［50］和 OSBP，运输胆固醇并伴随 PI4P的转移［51］，最近的研究发现其通过使用PI4P作为驱动力，在ER-Golgi界面建立固醇梯度［52］，病理状态下该过程失调从而引发脂质紊乱。

4 内质网与溶酶体（ER-lyso）的相互作用

溶酶体是细胞的再循环中心，在细胞内吞作用、胞吐作用和自噬作用等基本细胞生物过程中发挥重要作用。ER和溶酶体膜之间的短距离（＜30 nm）使静止的ER到溶酶体Ca2+转运不会引起全局［Ca2+］Cyt增加。然而目前对连接内质网-溶酶体的分子的认识知之甚少。在对接过程中，MCS间隙可以从20～30 nm减少到5～15 nm，以提供高度顺应Ca2+交换的功能构象。同时，ER溶酶体MCSs富含IP3R和溶酶体Ca2+通道如瞬时受体电位（TRP）通道TRPML1和双孔通道 TPC2。然后 Ca2+通过IP3R从ER释放，通过TRPML1／TPC2驱动Ca2+内流，导致Ca2+梯度急剧变化且在不同水平影响自噬过程［53-54］。TRPML1基因突变会导致人类Ⅳ型黏脂病，其临床特征包括精神运动迟缓、角膜混浊和视网膜变性［55］。

5 结语与展望

细胞器互作研究是当前生物医药领域前沿热点，其交互作用的关联点主要在膜接触位点（MCSs），本文综述了一部分定位于MCSs的关键蛋白分子，绘制了内质网-细胞器MCSs蛋白分子机制图（图1），总结了调节MCSs结构和功能的可能方式及其与疾病的关系（表1）。ER的连续性以及与其他细胞器之间的接触使得各种信号得以在整个ER网络中传播，随后协调细胞器之间的反应，促进有效的细胞内或细胞间的信号传导，通过对疾病状态下MCSs介导的细胞器互作变化的研究，可以进一步深入的阐明疾病发生发展的机制，发现相关的调控靶点，对于新药开发、临床治疗和预防有重要意义。例如，在神经退行性疾病发生发展中，MAM起着重要作用，AD患者的大脑线粒体分裂活性表现出增加，并以Aβ依赖的方式表达更高水平的 Drp1［56］。另外，MAM中的 Mfn2、Sig1R，ERGIC中的ATF6也在AD的发病过程中发挥重要作用［24，26，47］，是目前 AD治疗研究的重要靶点。又如，心血管疾病与Ca2+的稳态密切相关，临床上用于治疗心血管疾病的钙通道阻滞药主要通过选择性的阻滞PM上的Ca2+内流，从而减少胞内Ca2+的蓄积。除了ER-PM中某些蛋白如NCX1和TRPC6的上调参与了多种原发性高血压模型中高血压的发病机制外［9］，最近研究还发现靶向MAM中的Mfn、Drp等融合与分裂相关因子对于治疗心血管疾病具有巨大潜力［57］，为心血管疾病的治疗提供了新的靶点和方向。过去几年也发现了许多MCSs与肿瘤和肿瘤发生的关联，例如MAM中增加的Ero1α表达与肿瘤的过度增殖有关，抑制Ero1α的表达来抑制肿瘤细胞增殖可能是一条新的途径，同时心脏病进展也可能以Ero1α表达的增加为特征［58］，是否能成为心脏病治疗靶点值得进一步的研究。此外，PACS-2在多达40%的散发性结直肠癌活组织检查中发生突变，因此可以作为肿瘤抑制因子［58］。除了MAM，ER-PM中的SOCE在肿瘤细胞凋亡、增殖、迁移、侵袭、转移和血管生成的调节中均起着至关重要的作用［10］，对肿瘤转移的药物的研发具有重大意义。此外仍然有很多问题需要进一步探讨：膜间距的改变或维持是否对功能有影响；定位于MCSs上的蛋白的缺失是否会影响甚至消除其功能；细胞器的运动在其中的作用以及识别构成MCSs的组分的新技术新方法的探索等。总之，基于MCSs的细胞器互作分子时代已经到来，针对MCSs的组成和功能的研究是细化疾病机制研究的关键，也为相关药物研发提供了新的思路。