miRNA-223靶向FoxO3抑制肺结核大鼠巨噬细胞凋亡研究

洪爱玲 朱海燕 何贵清 苏菲菲

结核病是由结核分枝杆菌引起的一类严重危害人类健康的传染性疾病。结核分枝杆菌是一种兼性巨噬细胞寄生菌[1-2]，感染人体后首先寄生在巨噬细胞内。巨噬细胞凋亡后，连细胞内的结核分枝杆菌一起被清除[3]。而后，凋亡的巨噬细胞激活临近的未被寄生的巨噬细胞，增强机体巨噬细胞对致病菌的杀伤能力[4]。在细胞发生凋亡时，细胞膜上会出现一些异常的蛋白等标志物，邻近的巨噬细胞更容易将其当成抗体，从而对其吞噬清除。机体清除结核分枝杆菌伴随着细胞凋亡，细胞凋亡产生的异常蛋白又会对机体造成影响。因此，找到既可抑制细胞凋亡又可清除结核分枝杆菌的方法意义重大。研究发现，结核分枝杆菌感染人肺部巨噬细胞达到一定程度以后，TNF-α可介导巨噬细胞的外源性凋亡；巨噬细胞移动抑制因子（MIF）作为一种促炎症细胞因子，可抑制结核分枝杆菌的生长繁殖；叉头框转录因子3（FoxO3）是细胞的转录因子，可阻遏细胞周期。miRNA与肺结核的关系研究已有报道，但控制细胞凋亡的miRNA-223与肺结核的关系研究却不多见。本研究通过建立肺结核大鼠模型，采用治疗肺结核的药物异烟肼喂养，以上述因子为基础，探讨影响巨噬细胞凋亡的关键基因及相应通路蛋白，以期为研究抑制细胞凋亡的同时杀死结核分枝杆菌提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料 成熟雌性SD大鼠60只，体重184～273（221.5±1.4）g，购自中国科学院上海实验动物中心。异烟肼（北京双鹤药业股份有限公司，片剂，规格2ml∶0.1g）；TAE溶液（上海西唐生物科技有限公司）；琼脂糖、TBST溶液（上海徕创生物科技有限公司）；TNF-α抗体、MIF抗体、β-actin（美国 Sigma公司）；PBS、细胞裂解液（武汉博士德生物科技有限公司）；RT-PCR引物由北京奥科生物公司合成。电泳仪（美国Bio-Rad公司）；离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型构建 将60只大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、给药组，每组20只。正常组大鼠尾静脉注射0.2ml 0.9%氯化钠注射液。模型组和给药组大鼠尾静脉注射由结核患者痰液中分离的结核分枝杆菌（该杆菌已按结核病诊断细菌学检验规程验证为结核分枝杆菌，取分裂旺盛的模型菌，用0.9%氯化钠溶液溶解，每只大鼠注射0.2ml细菌悬液）。造模成功后，给药组大鼠隔日一次性灌胃12 mg/ml异烟肼药液1ml至造模第30天。监测各组大鼠造模第1、15、30天的体重变化。造模第30天时，以颈椎脱臼法处死各组大鼠，留取肺组织，委托上海捷瑞生物工程有限公司进行后续实验。

1.2.2 大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落计数 取每只大鼠全部左肺组织，加入2ml 0.9%氯化钠注射液后研磨成匀浆，再取组织液加等体积4%硫酸消化15min后，加入2.5mol NaOH调整至pH 7.0左右，接种于斜面培养基，置于37℃下培养5周，计数培养基上结核分枝杆菌菌落数。

1.2.3 大鼠肺组织miRNA-223、FoxO3 mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。将×50的TAE溶液稀释为×1的TAE溶液作为溶剂，称取0.5g琼脂糖，加入到TAE溶液中；于微波炉中加热煮沸，后加入4μl核酸染料，摇晃混匀。将琼脂糖凝胶水平放入电泳槽，依次加入5μl的 DNA Maker（β-actin）及 miRNA-223、FoxO3 PCR 引物（表1），拍照留存。以β-actin为内参，分析目的基因条带灰度值。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4大鼠肺组织TNF-α、MIF蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取每只大鼠全部右肺组织，用PBS冲洗3次，加入细胞裂解液在混匀机下冰浴破碎，于12 000r/min离心机中4℃离心15min，收集上清液于-80℃下冻存，使用时沸水浴煮沸5min，4℃保存。把NC膜放入平皿，后在容器中添加脱脂奶粉并在摇床上暗处封闭0.5～1.5 h。弃去奶粉，取出硝酸纤维素（NC）膜置于TBST溶液中洗涤3次。洗涤以后加入TNF-α、MIF一抗，在4℃下孵育过夜。NC膜于第2天取出，将膜放于TBST溶液中洗涤4次后加入二抗孵育，将配置好的显色液（a液和b液按1∶1的比例现用现配）滴加覆盖于NC膜上，约1ml从右至左缓慢滴加，后于暗室中胶片冲洗，扫描留存。以β-actin为内参，分析目的蛋白条带灰度值。

1.3 观察指标 观察并比较3组大鼠（1）造模第1、15、30天体重；（2）肺组织结核分枝杆菌菌落数；（3）肺组织miRNA-223、FoxO3 mRNA 表达水平；（4）肺组织 TNF-α、MIF蛋白表达水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 20.1统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠造模第1、15、30天体重比较 见表2。

表2 3组大鼠造模第1、15、30天体重比较（g）

由表2可见，造模第1天，3组大鼠体重比较差异无统计学意义（P＞0.05）。造模第15、30天，3组大鼠体重比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），且正常组＞给药组＞模型组（均P＜0.05）。

2.2 3组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数比较 见表3。

表3 3组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数比较

由表3可见，3组大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落数比较差异有统计学意义（P＜0.05），且正常组＜给药组＜模型组（均P＜0.05）。

2.3 3组大鼠肺组织miRNA-223、FoxO3 mRNA表达水平比较 见表4。

表4 3组大鼠肺组织miRNA-223、FoxO3 mRNA表达水平比较

由表4可见，3组大鼠肺组织miRNA-223、FoxO3 mRNA表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与正常组和给药组比较，模型组大鼠肺组织miRNA-223表达水平降低，FoxO3 mRNA表达水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而给药组与正常组大鼠肺组织miRNA-223、FoxO3 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 3组大鼠肺组织TNF-α、MIF蛋白表达水平比较见图 1、表 5。

图1 3组大鼠肺组织TNF-α、MIF蛋白表达电泳图

表5 3组大鼠肺组织TNF-α、MIF蛋白表达水平比较

由图1、表5可见，3组大鼠肺组织TNF-α、MIF蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与正常组比较，模型组大鼠肺组织TNF-α、MIF蛋白表达水平均升高（均P＜0.05），给药组大鼠肺组织MIF蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，给药组大鼠肺组织TNF-α、MIF蛋白表达水平均明显降低（均P＜0.05）。

3 讨论

结核病是一种由结核分枝杆菌引起的传染性极强的疾病，且致死率较高。结核分枝杆菌是一类寄居于巨噬细胞中的寄生菌，不能独自存活于人体内，当巨噬细胞被寄生以后发生凋亡，而后激活周围的未被感染的巨噬细胞。本研究结果显示，造模第1天，3组大鼠体重比较差异无统计学意义。而造模第15、30天，正常组大鼠体重＞给药组大鼠体重＞模型组大鼠体重。且喂养中观察到给药组大鼠结核病整体症状较模型组轻很多，接近正常组，行动略缓慢，毛发略显粗糙，有一定光泽，反应也与正常鼠很接近，说明经过异烟肼治疗，可以使患病大鼠的症状减轻。

结核分枝杆菌菌落计数可直接反映结核病的严重程度。本研究结果表明，模型组大鼠肺组织体外培养结核分枝杆菌菌落数明显高于正常组，正常组无结核分枝杆菌生长。给药组与模型组相比，未见或少见结核分枝杆菌生长。这说明经过异烟肼治疗以后患病大鼠的病症明显减轻，结核治疗效果明显。

TNF-α是由巨噬细胞产生的急性炎症细胞因子。研究发现，在结核分枝杆菌感染人肺部巨噬细胞达到一定程度以后，会引起巨噬细胞的外源性凋亡，这一凋亡已被证实是由TNF-α介导的，没有被感染的巨噬细胞无论在分泌TNF-α的水平上还是对TNF-α的敏感度上都低于被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞，过量的TNF-α可以激活TNF受体，从而介导细胞凋亡[5-6]。本研究结果表明，模型组大鼠肺组织TNF-α、MIF蛋白表达水平均明显高于给药组、正常组，这说明大鼠患病程度和TNF-α表达水平有关，而异烟肼治疗可以降低TNF-α表达水平，此结果也为监测结核病的严重程度提供可能的生物标志物。

miRNA与肺结核的关系研究已有报道[7-8]，miRNA可作为促进或抑制癌症的因子，调控细胞凋亡[9-10]。本研究结果显示，结核病的发生会影响miRNA-223的表达水平。模型组大鼠肺组织miRNA-223表达水平明显低于正常组，而给药组大鼠肺组织miRNA-223表达水平高于模型组。

Fox是细胞的转录因子，激活的FoxO3可以调控相关基因的转录，从而阻遏细胞周期[11-12]。本研究结果表明，模型组大鼠肺组织FoxO3表达水平明显高于正常组，说明结核分枝杆菌导致的巨噬细胞的凋亡是通过FoxO3途径；在给予异烟肼治疗后，FoxO3表达水平明显降低，基本接近正常水平。

综上所述，本研究通过构建大鼠肺结核模型，分析大鼠患病期间各指标变化，结果显示，模型组大鼠体重减轻，而给药组大鼠症状相对不明显。且本研究结果提示，异烟肼治疗可上调肺结核大鼠肺组织miRNA-223的表达，下调FoxO3的表达。由此推测miRNA-223或通过靶向作用于FoxO3抑制相关凋亡基因及蛋白的表达，从而抑制肺结核大鼠巨噬细胞凋亡。