MCP-1基因-2518A/G位点多态性与2型糖尿病视网膜病变的关系研究

程怡 薛诚 吴金友 林海洋 赵佳佳 毛小洁

随着2型糖尿病患病人数的增多，疾病本身及其慢性并发症已成为严重的社会负担。糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是2型糖尿病常见的慢性并发症之一，是发达国家成人致盲的主要原因[1]。多种途径的炎症反应损伤血管内皮，是DR的重要发病机制之一[2]。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）属于趋化因子家族成员，是一种对单核细胞有趋化作用的炎症细胞因子[3]。有证据表明，MCP-1参与介导感光细胞凋亡和视网膜血管再生[4]。位于MCP-1基因启动子区的-2518A/G位点多态性会影响MCP-1的表达[5]。基于此，本研究通过聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析（PCRRFLP）技术检测基因多态性，旨在探讨MCP-1基因-2518A/G位点多态性与DR的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014至2017年本院收治的2型糖尿病患者192例（DM组），其中男91例，女101例；年龄50～81岁。DM组患者均为中国浙江地区汉族人，相互之间无血缘关系，排除1型糖尿病、伴有急慢性感染性疾病、严重心脑血管病变、妊娠、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及因青光眼、白内障和其他眼底血管性疾病等原因导致眼底无法分级者。DM组患者住院期间由专业眼科医师行眼底检查及眼底照相。根据2013年中华医学会眼科学分会眼底病学组的分期方法[6]，将DM组患者分为DR组（93例）和非DR组（99例）；DR组又分为2个亚组，增殖性视网膜病变亚组（PDR亚组，45例）和非增殖性视网膜病变亚组（NPDR亚组，48例）。另择同期在本院行健康体检者109例作为对照组，其中男50例，女59例；年龄45～76岁。对照组受检者均为汉族人，实验室检查证实无糖尿病，无高血压、心脏病、肝脏和肾脏疾病史，且无糖尿病、眼底疾病家族史。本研究获医院医学伦理委员会批准，研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集并记录DM组患者与对照组受检者年龄、性别、糖尿病病史及治疗史、其他重大疾病史、家族史等，测身高、体重、收缩压、舒张压及腰围，计算BMI；留取血标本，测定空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（2hPG）、糖化血红蛋白（HbA1C）、C 肽、TC、TG、HDLC、LDL-C等生化指标。

1.2.2 MCP-1基因-2518A/G位点多态性检测 采用PCR-RFLP技术检测基因多态性。采用德国QIAGEN公司的DNA提取试剂盒（50T，51104）提取的DM组患者与对照组受检者外周血白细胞DNA作为模板，聚合链式反应上游引物序列5′-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3′，下游引物序列 5′-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3′，扩增产物大小为930bp。反应条件：94℃预变性10min，94℃变性 30s，64℃退火 30s，72℃延伸 30s，上述循环 40次，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物以PvuⅡ内切酶（New England Biolabs，US，25 000units，R0151）进行酶切反应，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后于紫外线成像仪中观察。由于MCP-1基因-2518A/G位点有PvuⅡ酶切位点，所以AA基因型酶切片段为930bp，AG 基因型为 930、708 和 222bp，GG 基因型为708和222bp。选取经酶切鉴定携带不同基因型的PCR产物样本各1份委托英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，与酶切结果进行对比。

1.3 观察指标 （1）比较DR组、非DR组和对照组一般情况及生化指标；（2）比较DM组患者与对照组受检者MCP-1基因-2518A/G位点基因型和等位基因频率分布情况；（3）分析DR相关危险因素。

1.4 统计学处理 应用SPSS 24.0统计软件。计算各组的基因型和等位基因频率分布情况，采用Hardy-Weinberg平衡公式检验各组基因型是否达到遗传平衡。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两组比较采用两独立样本t检验；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。DR相关危险因素分析采用logistic回归。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DR组、非DR组和对照组一般情况及生化指标比较 DR组与非DR组患者年龄、收缩压、舒张压、腰围、BMI、FPG、2hFPG、HbA1C、TG、LDL-C 比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。DR、非DR组患者年龄、收缩压、舒张压、腰围、BMI、FPG、2hFPG、HbA1C、TG、LDL-C 均高于对照组受检者（均P＜0.05）。DR组患者年龄、糖尿病病程均大于非DR组患者（均P＜0.05），而DR组患者与非DR组患者收缩压、舒张压、腰围、BMI、FPG、2hPG、HbA1C、C 肽、TC、TG、HDL-c、LDL-c 比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 1。

表1 DR组、非DR组和对照组一般情况及生化指标比较

2.2 DM组患者与对照组受检者MCP-1基因-2518A/G位点基因型和等位基因频率分布情况比较 DM组患者AA基因型频率为29.2%，高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；DM组患者A等位基因频率为51.8%，高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。DR、非DR、对照组AA基因型频率分别为37.6%、21.2%、14.7%，A等位基因频率为57.0%、47.0%和39.4%，DR组AA基因型频率高于非DR组和对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），DR组A等位基因频率高于非DR组和对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。PDR亚组与NPDR亚组MCP-1基因-2518A/G位点基因型频率和等位基因频率比较均无统计学差异（均P＞0.05），见表2。

表2 DM组患者与对照组受检者MCP-1基因-2518A/G位点基因型和等位基因频率分布情况比较[例（%）]

2.3 DR相关危险因素分析 以DR的发生与否为因变量，选择MCP-1基因-2518A/G位点基因型、年龄、糖尿病病程、收缩压、舒张压、腰围、BMI、FPG、2hPG、HbA1C、TC、TG、HDL-C 和 LDL-C 为自变量，作 logistic回归分析，结果显示，MCP-1基因-2518A/G位点多态性及糖尿病病程与DR的发生有关，AA基因型及糖尿病病程长是DR发生的危险因素，见表3。

表3 DR相关危险因素的logistic分析

3 讨论

DR是糖尿病微血管并发症之一，其发病是由多种因素共同参与、相互作用导致，具体机制尚不十分明确。研究发现，多种炎症细胞因子和趋化因子参与DR的发病过程，包括血管内皮生长因子、细胞间黏附分子-1和MCP-1等[7-9]。

MCP-1是一种炎症细胞趋化因子，参与多种在单核细胞及巨噬细胞内发生的反应，包括诱导超氧化阴离子、细胞因子产生和黏附分子表达[9]。在动物试验中发现，糖尿病大鼠玻璃体、视网膜血管壁和视网膜神经细胞内的MCP-1水平升高，激活视网膜小胶质细胞，释放炎症因子，参与DR相关的炎症反应[10]。葡萄糖和糖化血清白蛋白刺激MCP-1在视网膜色素上皮细胞内的信号表达[11]。此外，还有研究发现眼内的MCP-1水平在DR患者中较高，为对照组的2.2倍[12]。

关于MCP-1基因多态性与DR的相关性研究目前报道不多，且结论并不一致。Jeon等[13]在对590例2型糖尿病患者的研究中发现，MCP-1基因-2518A/G位点AA基因型与PDR的发生有关，而Katakami等[14]及Dong等[15]研究却认为-2518A/G位点GG基因型及G等位基因增加DR包括PDR的患病风险。本研究以中国浙江地区汉族人为研究对象，比较了DM组和对照组MCP-1基因-2518A/G位点多态性的分布差异。结果表明，DM组AA基因型频率和A等位基因频率高于对照组，提示AA基因型及A等位基因与2型糖尿病易感性有关。该结果与马江波等[16]研究结果相符。本研究还发现，DR组AA基因型频率和A等位基因频率高于非DR组，logistic回归分析发现2型糖尿病患者MCP-1基因-2518A/G位点多态性及糖尿病病程与DR的发生有关。

本研究结果反映了浙江地区汉族人MCP-1基因-2518A/G位点多态性与DR的关系，该位点的多态性可能通过影响MCP-1基因的转录、翻译影响视网膜血管表达MCP-1，趋化吸引单核细胞的聚集从而引起毛细血管的阻塞，同时诱导多种途径的炎症反应损伤血管内皮，最终导致DR的发生。本研究结果与目前已知的国内外研究结果并非完全一致的原因可能有：首先，该基因位点突变存在种族差异性，基因型及等位基因的频率在各项研究中并不一致；其次，部分其他研究样本的糖尿病病程较短，各组间血糖水平存在差异，本研究中DR组和非DR组糖尿病病程均较长（平均病程＞10年），而两组间血糖水平无统计学差异；但是本研究样本量不够大（301例）可能也是造成结果偏差的原因。

综上所述，本研究结果显示MCP-1基因-2518A/G位点多态性与2型糖尿病患者DR发生有关，其中AA基因型可能是浙江局部地区汉族人群中2型糖尿病患者发生DR的危险因素，A等位基因可能增加该人群DR的发生风险。但由于DR的发生、发展是多种遗传和环境因素共同作用的结果，进一步研究MCP-1基因与其它基因以及环境因素等的相互影响有助于深入揭示DR发生的病理生理机制。