PTEN-Long对肝癌细胞的抑制作用研究

2019-08-28张谢谭麟林剑毛琦淇李宏

浙江医学 2019年15期

张谢谭麟林剑毛琦淇李宏

我国HBV携带者约9 000万，每年新发肝癌病例约32万，占全球55%；60岁以下男性肝癌发病率和死亡率居恶性肿瘤首位，肝癌患者5年生存率不足10%，形势不容乐观[1-2]。目前，手术是肝癌首选的治疗方法，但是手术治疗主要针对早期肝癌患者；对于晚期及术后复发患者，探寻新的治疗方法使其延长生存时间、提高生活质量已十分迫切。2013年Hopkins等[3]发现了第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）基因编码PTEN的一种变形体，命名为PTEN-Long，其与PTEN高度同源。PTEN-Long在PTEN的N端增加了173个氨基酸，且在进化上高度保守，是新发现的一个具有磷酸酶活性的抑癌蛋白[2-5]。PTEN-Long的存在依赖于PTEN的表达，且表达水平和PTEN成正比[6]。本研究拟从PTEN-Long表达水平较高的人肾上皮293T细胞溶解产物中分离纯化PTEN-Long，观察其对肝癌细胞的抑制作用，以及对肝癌移植小鼠的肿瘤抑制作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 实验动物 129S1/SvlmJ小鼠40只，SPF级，体重18～22g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，在宁波大学动物实验中心分笼饲养。

1.1.2 主要材料人肾上皮293T细胞及肝癌HepG2、HUH6、FOCUS细胞（中国科学院上海细胞库），DMEM培养基（美国 Gibico公司，批号：10569010），FBS（美国Gibico公司，批号：10091130），PTEN（138G6）抗体（美国Cell Signaling公司，批号：9559），鼠抗兔二抗（美国Santa Cruz公司，批号：sc-2358），BCA 蛋白测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0012），单溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS法，美国Promega公司，批号：G3580），脂质体2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司，批号：11668）；pcDNA3.1-PTEN-Long质粒由美国纽约斯隆癌症中心赠送。

1.1.3 主要仪器高速冷冻离心机（micro21R型，美国Thermo Fisher公司），超纯水（Direct-Q3型，美国Millipore公司），酶标仪（680型，美国 Bio-Rad公司），细胞培养箱（BB15型，美国Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 293T细胞和肝癌 HepG2、HUH6、FOCUS细胞用含10%FBS、双抗（50mg/ml青霉素+50mg/ml链霉素）的高糖 DMEM培养基，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。2×105个细胞/3ml接种于直径100mm培养皿中，待其贴壁长到全皿的80%～90%时收集细胞。

1.2.2 细胞转染按照脂质体2000转染试剂盒说明书将pcDNA3.1-PTEN-Long质粒转染进入293T细胞。转染前1d，细胞铺板于直径100mm培养皿中，使其转染密度约为90%。转染试剂用Opti-MEM无血清培养基稀释，细胞也用Opti-MEM无血清培养基孵育。转染6h后，转染培养基换成完全培养基（包含10%FBS和50mg/ml青霉素+50mg/ml链霉素）。细胞转染48h后，提取蛋白。

1.2.3 PTEN-Long分离纯化将转染pcDNA3.1-PTENLong质粒后的293T细胞用1～2ml PBS洗涤3次，加入3ml 0.25%胰酶-EDTA进行消化，血清终止消化；将细胞液移到15ml无菌离心管中，1 000r/min离心3min；然后重新悬浮在含1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的细胞裂解液中。悬浮液经Dounce型组织碾磨器碾磨数次后置于冰上孵育30min，使细胞充分裂解；裂解液离心10min（15 000r/min），弃去上清液。将沉淀重新悬浮在含0.5mol/L NaCl的细胞裂解液中碾磨数次，后置于冰上孵育30min；裂解液离心10min（15 000r/min），留取上清液。在上清液中加入40%的硫酸铵溶液直至PTEN-Long沉淀，沉淀后的PTEN-Long离心10min（15 000r/min），与未沉淀杂蛋白分离。沉淀中的PTEN-Long用细胞裂解液重新溶解，分别经疏水柱（HIC）、阳离子交换柱（SP）、阴离子交换柱（Q）分离纯化，得到纯化的PTEN-Long蛋白。

1.2.4 PTEN-Long蛋白表达检测经分离纯化的PTEN-Long蛋白用Western blot法检测表达纯度。按蛋白裂解液说明书提取蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，蛋白变性后行SDS-PAGE电泳，湿转到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入3%BSA封闭液，室温下孵育2h，加入 PTEN（1∶300），4℃封闭过夜，弃一抗，Tris-HCl缓冲液+吐温（TBST）洗3遍。加入1∶10 000的二抗，室温孵育2h后，弃二抗，TBST洗3遍，增强化学荧光发光法显影，曝光。

1.2.5 肝癌HepG2、HUH6、FOCUS细胞存活情况检测采用MTS法。分别将HepG2、HUH6、FOCUS细胞悬液以每孔 100μl[含（5～8）×103个细胞/ml] 接种于 96 孔板中，并加入终浓度为 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40nmol/L 的 PTEN-Long（100μl/孔），并设空白对照组，均设置3个复孔。每孔加入MTS液 10μl，孵育4h后测定490nm吸光度值，以此反映PTEN-Long对细胞存活的影响。

1.2.6 动物模型建立与分组将40只小鼠按随机数字表法分成PTEN-Long组和对照组，每组20只。消毒小鼠大腿根部皮肤，并在消毒部位接种0.2ml含细胞数5×105个的肝癌HepG2（两组分别各 10只）或 HUH6（两组分别各10只）细胞悬液。对照组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.2ml，1次/d；PTEN-Long组小鼠腹腔注射PTEN-Long（剂量4mg/kg体重，溶于0.2ml 0.9%氯化钠注射液中），1次/d。用游标卡尺测量各组小鼠肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，肿瘤体积=1/2ab2（a、b分别表示长径、短径）。

1.3 观察指标（1）PTEN-Long分离纯化结果；（2）PTEN-Long对肝癌 HepG2、HUH6、FOCUS 细胞的抑制作用；（3）比较PTEN-Long组与对照组小鼠肿瘤体积。

1.4 统计学处理应用GraphPad 5.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN-Long分离纯化结果 Western blot法检测分离纯化后的PTEN-Long蛋白（图1），纯化后PTENLong蛋白纯度较高，约80%。

图1 PTEN-Long分离纯化结果电泳图

2.2 PTEN-Long 对肝癌 HepG2、HUH6、FOCUS 细胞抑制作用观察结果与空白对照组比较，5nmol/L浓度以上的PTEN-Long对肝癌HepG2、HUH6细胞有明显的抑制作用，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而PTEN-Long对肝癌FOCUS细胞无明显抑制作用，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。且PTEN-Long对肝癌HepG2、HUH6细胞的半抑制浓度分别为12、26nmol/L（图2）。

图2 PTEN-Long对肝癌 HepG2、HUH6、FOCUS细胞抑制作用比较（*P＜0.05）

2.3 PTEN-Long组与对照组小鼠肿瘤体积比较与对照组相比，从14d开始，PTEN-Long组肝癌HepG2细胞移植小鼠肿瘤体积明显较小（图3），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与对照组相比，从12d开始，PTENLong组肝癌HUH6细胞移植小鼠肿瘤体积明显变小（图4），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

最新统计数据显示，全球肝癌5年生存率为5%～30%，而我国大陆地区肝癌5年生存率仅从2000至2004年时的11.7%上升到2010至2014年的14.1%，生存率仍不乐观[7]。故深入研究肝癌发生、发展的分子机制，寻求新的肝癌靶向治疗药物，对于延缓疾病进程、降低病死率有着重要的临床意义。

PTEN基因在人类很多癌症中发生突变或缺失，且几乎一半的肝癌患者存在PTEN基因的缺失[8-9]。HBV感染的肝癌患者PTEN蛋白水平明显升高，但AKT下调，提示PTEN参与了HBV中不受控制的或增加的蛋白表达[10]。PTEN低表达的肝癌患者术后疾病无进展时间与总生存率明显下降，且肿瘤体积更大，甲胎蛋白（AFP）水平更高，这说明PTEN与肝癌的发展和预后有明显的临床相关性[11]。因此，临床对PTEN用于癌症治疗抱有很高期望，认为通过间接增加PTEN在细胞内的表达，或是利用腺病毒等载体将PTEN的cDNA重新引入有PTEN基因缺陷的患者体内，可抑制肿瘤的发生、发展[12-13]。

2013年发现的一种新PTEN变体PTEN-Long，已被鉴定为从PTEN mRNA的5′UTR中的另一翻译起始密码子（CUG）翻译，在N端包含比PTEN额外的173个氨基酸，而在N端多出来的结构能够协助PTENLong 进入细胞，从而发挥作用[2，6，14]。本课题组前期研究发现，PTEN-Long可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路，抑制肿瘤的发生[15]。有研究显示，与PTEN相比，PTEN-Long以外源蛋白形式发挥抗病毒作用，且PTEN-Long增强了Ⅰ型IFN和促炎症细胞因子的反应，提示PTEN-Long与PTEN相比可能具有更多的额外功能[16]。