疲劳运动对大鼠脑缺血后额叶皮质脑血流量的影响

杨寓迪， 刘 琳， 王伟佳， 王冬雪， 张健松 ， 赵 瑛

脑卒中是严重威胁现代人健康的疾病，其致死率在所有疾病中居第三位[1]。脑卒中指由脑部血管破裂及阻塞引起血液循环障碍所导致的疾病，其中颈动脉狭窄或闭塞是20%～30%脑卒中患者的主要诱发因素[2]。其中缺血性卒中具有较高的致残率[3]，脑卒中后脑血流量呈低灌注或血流减少等，会导致氧和能量供应中断，神经细胞死亡并引发神经系统功能障碍[4]。随着脑缺血情况的不断加剧，由此引发的血管性痴呆已成为脑卒中困扰社会和家庭的主要并发症之一[5]。

近年来体育运动逐渐成为青年人和老年人追捧的生活方式之一。有大量的研究报道指出适宜的运动能够延缓心脑血管疾病的发生[6]。研究显示适当的运动可以提高高血压、超重、高胆固醇血症和糖尿病患者的生存率[7]，降低认知障碍发生的风险[8]，对心血管疾病的预防作用显著[9]。但也有许多人一味追求运动的时间和运动的强度，一旦运动强度超过人体负荷则表现为过度运动或疲劳运动。有研究表明，过度运动或疲劳运动可能会导致海马出现细胞核固缩、深染，线粒体损伤以及海马中脑脑源性神经营养因子表达的下调，海马功能受损，引起记忆能力下降等问题[10]。

本文采用双侧颈总动脉结扎的方法建立大鼠脑缺血模型，并于脑缺血前进行大鼠疲劳运动训练。采用双通道激光多普勒脑血流仪对其脑血流量进行测定，采用Morris水迷宫实验对大鼠的学习记忆情况进行测定，分别观察疲劳运动对正常及脑缺血大鼠脑血流量和学习记忆功能的变化情况。为疲劳运动对脑卒中后的病程影响提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级成年健康雄性Wistar大鼠120只，体重为180～240 g。由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证编号：201700018990。实验动物采用标准饲料喂养，实验期间自由饮水、摄食。

适应性饲养1 w后，根据体重分层随机分为4组：阴性对照组(SO，n=20)，疲劳运动组(OE，n=20)，双侧颈总动脉结扎组(2-VO，n=40)，双侧颈总动脉并疲劳运动组(OE+2-VO，n=40)，训练2 w后对2-VO组及2-VO+OE组进行双侧颈总动脉结扎，建立模型。

1.2 实验方法

1.2.1 疲劳运动模型的建立 动物跑台是依鼠跑步运动而设计的实验装置，运动强度可通过调整跑步的时间、跑步速度以及跑台的坡度来控制，大鼠适应性饲养后开始训练，采用递增强度跑台运动，坡度为15°，将大鼠放置在跑道后，初始速度为5 m/min，逐渐加速，直到增速至30 m/min，跑至力竭，以120 min为期限，1次/d，训练14 d，记录大鼠完成训练的情况，建立疲劳运动模型[11]。SO组和2-VO组仅将大鼠置于跑台上但不转动跑台。

1.2.2 脑缺血模型的建立 疲劳运动后对2-VO组及2-VO+OE组采用永久性结扎双侧颈总动脉(2-VO)的方法建立脑缺血大鼠模型。手术组大鼠术前12 h禁食、4 h禁水。用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈正中切开，分离暴露左、右侧颈总动脉，套以“0”号丝线双重结扎，逐层缝合，SO组及OE组大鼠除不结扎颈总动脉，其余同手术组。术后每天肌肉注射青霉素[12]。

1.2.3 大鼠额叶皮质脑血流量的测定 脑血流量实验前的预处理：实验前1 w，所有大鼠麻醉后俯卧，放置于脑立体定位仪上，固定头部，采取平颅固定法进行大鼠头颅的立体定位。之后头部剃毛，剪开头部皮肤2 cm，用过氧化氢擦拭清除软组织，暴露出颅骨。参照Paxions-Watson大鼠脑立体定位图谱(第6版)[13]，确定额叶(FrA)位置(中心点为前囟前5 mm，矢状缝右侧旁开2 mm)，为后期正式实验做准备。

分别于疲劳运动训练或双侧颈动脉结扎14 d后，采用moorVMS双通道激光多普勒脑血流仪进行脑血流量的测定[14]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉20 min后，将多普勒光纤探头固定至额叶处，记录脑血流量、红细胞聚集度、红细胞运动速度、回光强度等，测试时间为10 min。脑血流量的单位采用的是血流灌注单位PU，红细胞聚集度、红细胞运动速度、回光强度的单位为AU。

1.2.4 学习记忆能力的测定 脑血流测定28 d后进行Morris水迷宫测试[15]：实验前分别在水池四个方向贴上不同标记物，分别为三角形，正方形，圆形和五角星纸片。放入平台，使平台低于水面2 cm，控制水温在(20.0±2.0)℃。实验开始前移除平台，将大鼠放入池内适应环境，避免有刺激对大鼠造成应激反应。

定位航行实验：每天相同时间点进行实验，将大鼠随机从不同象限(除目标象限)面壁置入池内，记录120 s内寻找平台的时间即逃避潜伏期，逃避潜伏期下降表示学习记忆增强。如果大鼠在120 s内找到平台，记录120 s内实际逃避潜伏期；如果在120 s 内未找到平台，由实验者将其引上平台并停留30 s，以熟悉环境，逃避潜伏期记录为120 s。大鼠每天训练2次[16]，连续训练5 d，然后进行定位航行测试。

空间探索实验：将平台移除，记录大鼠穿越平台次数。每次训练完成后将小鼠取出擦干，以防止低体温造成的应激。测试过程中保持实验室内灯光、物品等空间参照物摆放位置不变，排除干扰因素对实验结果的影响。

可视平台实验：将水迷宫内水排出部分，使水面低于平台1～2 cm，在平台处放置一个小旗，其余同定位航行实验。

2 结 果

2.1 疲劳运动时期大鼠运动完成情况结果 大鼠疲劳运动完成百分率见图1，在训练最初的7 d时间内，绝大多数大鼠不能在120 min内完成训练，表明这种强度对大鼠来说属于疲劳运动。随着训练周期的延长，部分大鼠均能顺利完成，训练10 d以后除有个别大鼠因身体素质原因不能完成外，其它大鼠能够完成120 min的训练。

图1 完成训练大鼠的百分率(%)

2.2 脑血流量及其相关参数的实验结果 运动2 w后，与SO组相比，OE组脑血流量显著升高(P<0.05)，2-VO组血流量显著降低(P<0.01)，与2-VO组比较，OE+2-VO组脑血流量显著降低(P<0.01)。结果提示，脑缺血后大鼠脑血流量显著下降，但疲劳运动后的脑缺血大鼠脑血流量下降更为明显，即使疲劳运动会使脑血流量有小幅度回升，这种情况也不能缓解。这种脑血流量的大幅度下降提示疲劳运动可能使得脑血流的损伤加剧。与2-VO组比较，OE+2-VO组红细胞运动速度显著降低(P<0.01)，结果提示疲劳运动合并脑缺血后脑血流量的显著下降可能与红细胞运动速度下降有关。与OE组比较，OE+2-VO组红细胞聚集度显著下降(P<0.05)。回光强度是反向散射光强度的指标，受屋内光强度的影响，可以实时监测探头的状况，与脑血流量成反比例，固保持回光强度一致，使脑血流量不受光强的影响，在本实验中回光强度各组大鼠之间无显著差异(P>0.05)，所测得的脑血流量值较为准确(见表1)。

表1 血流量及相关参数测定结果

与SO组相比*P<0.05有显著性差异**P<0.01有非常显著性差异；与OE组相比▲P<0.05有显著性差异▲▲P<0.01有非常显著性差异；与2-VO组相比，●P<0.05有显著性差异●●P<0.01有非常显著性差异

2.3 Morris水迷宫学习记忆测试结果 模型建立后42 d后，对各组大鼠进行Morris水迷宫测试(见表2)，与SO组相比，OE组逃避潜伏期和穿台次数无显著差异(P>0.05)，2-VO组和OE+2-VO逃避潜伏期显著增加，穿台次数显著降低(P<0.05)，与2-VO组相比，OE+2-VO组逃避潜伏期显著增加(P<0.05)。说明运动对大鼠的学习记忆并无明显的影响，但脑缺血42 d后动物的学习记忆能力会显著下降，运动后脑缺血的动物学习记忆障碍更为明显。平均速度结果显示各组大鼠的平均速度无明显变化(P>0.05)，排除了由于动物自身的因素对实验结果造成的影响。

表2 各组大鼠Morris 水迷宫测试期结果

与SO组相比*P<0.05有显著性差异**P<0.01有非常显著性差异；与OE组相比▲P<0.05有显著性差异▲▲P<0.01有非常显著性差异；与2-VO组相比●P<0.05有显著性差异●●P<0.01有非常显著性差异

3 讨 论

目前大多数文献关于建立过度运动或疲劳运动的模型采取的方式主要有两种：强迫游泳及跑台训练[17]。在本实验中，因后期要采用Morris水迷宫对大鼠的学习记忆能力进行测试，强迫游泳实验可能会对其造成干扰，且脑血流前对大鼠的头部要进行预处理，为了防止伤口感染，故而本实验采用动物跑台建立疲劳运动模型。在训练最初的7 d时间内，绝大多数大鼠不能在120 min内完成训练，表明这种强度对大鼠来说属于疲劳运动。但随着大鼠适应能力的不断加强，10～14 d绝大多数大鼠均可完成训练，因此将疲劳运动训练时间定为14 d。这种做法既能减少大鼠的死亡率，又符合大鼠疲劳运动病理过程。SO组和2-VO组仅将大鼠置于跑台上但不转动跑台，排除应激反应可能造成的影响。

脑血流的主要功能是运输物质和氧气，以及带走废物和过多的热量，脑血流量的变化是很多脑血管疾病的病理生理基础之一[18]。研究结果显示疲劳运动合并脑缺血后可造成脑血流量的显著下降，且这种下降程度要大于单纯结扎造成的脑血流的下降。提示疲劳运动合并脑缺血可能造成更为严重的脑损害，这种下降可能与红细胞运动速度下降有关，与红细胞聚集浓度无关。

研究发现脑部血流量供应不足会导致白质疏松，以白质的退行性改变为主要特点[19]，从而导致机体神经功能损伤、学习记忆功能障碍等，且在脑缺血42 d为损伤关键点[15]。因此本实验采用Morris水迷宫测定大鼠学习记忆功能，评价疲劳运动对大鼠脑缺血后行为功能的影响。结果发现双侧颈总动脉结扎42 d后大鼠会出现学习记忆障碍，与文献报道相吻合[15]。额叶皮质与注意力、短时记忆任务、推理感等高级心理活动有关，在非任务的长期记忆保持中也起着非常重要的作用。额叶皮质缺血会出现学习记忆障碍[20]。这一点在本实验中也得到验证。研究结果发现大鼠的学习记忆功能与额叶皮质脑血流量呈现一定的正相关。经双侧颈总动脉结扎后的大鼠会出现学习记忆障碍，而在结扎之前进行疲劳运动训练的大鼠脑血流量下降幅度更大，其出现学习记忆障碍的程度也较单纯的结扎颈总动脉要深，可能因为运动的强度过大导致了大鼠海马细胞的凋亡增加，从而加重了学习记忆障碍的发生[9]。

适度运动能够强身健体，改善自身的血液循环，但对于刚开始锻炼的人来说，要结合自身的条件进行运动，近来，运动过程中猝死的事件也屡见不鲜，“暴走”作为运动中的一项，也曾经引起过热议，对于不常运动的人来说，不少人在此之前并未参加过规律性的体育锻炼，就进行10～20千米以上的运动，除了对机体运动系统产生损伤外，还会加大神经细胞损伤和凋亡的风险，若是患有认知障碍疾病后，其发展成痴呆的速度也会较快，故应该结合自身的条件，选择适宜自己的运动，在运动期间也应该循序渐进，避免过度的疲劳运动对机体造成的损伤。