毛木耳多糖复合酶解-酵母发酵产业化提取工艺研究
2019-08-27孙海黄荣
孙 海 黄 荣
（成都正仁宇泽生物科技有限公司，四川成都610081）
毛木耳（Auricularia polytricha）又称黄背木耳、粗木耳等，属于担子菌纲，木耳目，木耳科，木耳属中的毛木耳种[1]。野生毛木耳主要分布在四川、云南、福建等低海拔温暖湿润山区。其规模化、区域性栽培地主要集中在四川省什邡市和福建省部分区域。毛木耳子实体胶质滑韧，子实体背面富有绒毛，营养丰富，含木耳多糖、麦角甾醇、氨基酸、脂质体、纤维素、胡萝卜素、维生素A、B1、B2及各种无机元素钾、钠、钙、镁、铁、铜、锌、锰、磷等营养成分，素有“黑色保健食品”和“树上海蜇皮”之美称，有补气血、降血液黏度、降血脂、清肺润燥、清涤胃肠、通便降压、化结石、抗血栓、预防动脉粥样硬化、中风和心肌梗死等功效[2-3]。毛木耳的多种药效与其含有丰富的多糖密切相关。毛木耳多糖属于酸性杂多糖，是由五种单糖和葡萄糖醛酸组成[4]。木耳多糖具有止血、抗凝血和降血脂、抗衰老、改善心脏功能、免疫及抗肿瘤功能、对机体细胞有保护等多种作用[5]。
毛木耳多糖提取是多糖广泛应用的基础，因此获得高效的毛木耳多糖提取技术尤为重要。目前国内还没有统一的毛木耳多糖产业化提取工艺，已有浸提方法提取毛木耳多糖工艺耗时、耗能、低效，而且对环境的影响较大，工业化生产难度较高。研究利用复合酶酶解、酵母恒温恒压发酵来提取四川省什邡产野生毛木耳中多糖，并确定最佳产业化制备工艺条件。该方法利用复合酶酶解毛木耳的不溶性纤维、胶质和植物蛋白成分，并通过酵母发酵使毛木耳组织蓬松（酵母与糖分解产生二氧化碳和乙醇，加大罐内压力，增强组织渗透压力）和细胞壁膨胀破裂有利于充分提取毛木耳中的多糖成分[6]，使工艺更具有产业化生产优势，同时降低能耗并改善环境污染。为优化毛木耳多糖的提取工艺提供参考，同时为毛木耳多糖的综合开发和深加工奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
材料与试剂：毛木耳（四川什邡市涧氐镇木耳种植协会提供）；纤维素酶（2万U/克）、中性蛋白酶（3万U/克）、果胶酶（3万U/克），南宁庞博生物工程有限公司；安琪低糖型酵母，安琪酵母股份有限公司；无水葡萄糖，成都科伦医药有限公司；其他药品均为市售分析纯。
设备仪器：恒温恒湿发酵罐5 L，江苏科海生物工程设备有限公司；锥型过滤桶5 L，温州伯泰机械科技有限公司；浓缩罐10 L，温州伯泰机械科技有限公司；BLK-FD-100真空减压干燥箱，江苏昌实干燥科技有限公司；KH30RF离心机，湖南凯达；754N紫外-可见分光度计，山东晨托科学仪器设备有限公司；电子天平，杭州友恒称量仪器有限公司；粉碎机，温岭奥力中药机械设备有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 原材料预处理
野生黄背毛木耳洗净后晾干，剔除发霉、变质等不合格木耳及杂质，将干木耳粉碎，过10目筛，制成干木耳粉，置于干燥阴凉处备用。
1.2.2 毛木耳多糖提取率的计算
毛木耳多糖含量的测定。参照文献[6-7]，采用苯酚—硫酸法测定毛木耳多糖含量。绘制葡萄糖标准曲线为A=14.86C-0.024，相关系数r2=0.9979，线性范围在0～100 μg/mL，如图1所示，并计算毛木耳多糖提取率。
多糖含量（%）=（C×D×F）/W×100
上式中：C为试液中的葡萄糖浓度（mg/L），D为多糖的稀释因素，F为换算因子，W为毛木耳质量。
1.2.3 毛木耳多糖两种提取方法比较
在实验室少量样品试验基层上，进行5 kg料和50 kg料扩大试验。
1.2.3.1 回流提取法
取毛木耳样品1.0 g，配制成一定液料比的溶液，经过回流浸提，将提取液离心取上清液、浓缩、后加入4倍95%浓度乙醇静置沉淀多糖、冷冻离心、干燥得到黄背毛木耳多糖。
按上述工艺分别进行5 kg和50 kg中试提取试验。
工艺流程：
原料处理→加水混合（加水量通常80%～100%）→加热回流（70℃）→回收回流液→调节pH（6～8）→浓缩1/6→醇析→干燥→粉碎→制得多糖粗品
1.2.3.2 复合酶解-酵母发酵回流提取法
取毛木耳样品1.0 g，按料液比为1∶35配成溶液，然后加入0.1 g一定量的复合酶（纤维素酶∶中性蛋白酶∶果胶酶=0.6∶0.4∶0.8）酶活力（2600U），在温度为80℃，pH为6.0的条件下酶解80 min高温灭酶后再用安琪低糖型酵母在发酵压力0.15～0.2 MPa，温度为40℃，发酵20 h，在回流温度60℃经过回流浸提120 min，将提取液离心取上清液、浓缩后加入4倍95%乙醇静置沉淀多糖、冷冻离心、干燥得到黄背毛木耳多糖。
按上述工艺分别进行5 kg和50 kg中试提取试验。
工艺流程：
原料处理→干燥→粉碎（10目）→称量→酶解→发酵→回流浸提→过滤→离心取上清液→浓缩至1/4→调节pH至6～8→醇析→真空减压干燥→粗品→粉碎→得毛木耳多糖
1.2.4 复合酶解-酵母发酵法回流提取法（单因素试验）
分别将纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶作为水解用酶，然后用安琪低糖型酵母发酵，以酶解时间、酶解温度、罐内发酵温度、发酵时间、发酵罐压力、回流浸提时间、回流温度、料液比为可变因素，研究各因素对多糖得率的影响，得到优化的提取工艺。
2 结果与分析
2.1 两种提取方法毛木耳多糖提取率
采用回流提取法（5 kg和50 kg料），其多糖提取率分别为1.42%和1.40%；采用复合酶解-酵母发酵回流法（5 kg和50 kg），其多糖提取率分别为3.60%和3.59%。
采用复合酶解-酵母发酵回流法新工艺，有以下优势：①粗多糖提取率高于传统工艺＞150%；②减少用水量，降低环境污染因素；③减少了乙醇用量，提高了生产效能；④提高了生产经济效能，更利于产业化生产。
2.2 复合酶解-酵母发酵回流提取法单因素试验结果
2.2.1 酶解温度对毛木耳多糖提取率的影响
由表1可见，在相同发酵条件、回流浸提时间温度、料液比、酶解时间为80 min条件下，毛木耳多糖提取率随着酶解温度上升而上升，但温度升高到90℃，提取率反而下降。酶解温度在80℃时提取率最高，而且回流浸提良好，回流速度均匀。优选方案为：酶解温度为80℃，酶解时间为80 min。
表1 酶解温度对毛木耳多糖提取率的影响
2.2.2 罐内发酵温度对毛木耳多糖提取率的影响
在人口老龄化加速席卷全球的客观条件下，不仅我国面临着处理职工退休的问题，世界各国同样面对着这个问题，相对于我国进入人口老龄化的速度，美国与日本等国家首当其冲，率先面临着人口老龄化带来的危机。因此，借鉴国外延迟退休年龄政策在实践中的应用经验，对于我国制定符合中国国情的延迟退休年龄政策，有着不言而喻的重要性。
由表2可见，在酶解温度为80℃，相同时间、压力其他条件不变条件下，随着罐内发酵温度上升，毛木耳多糖提取率先高后低，发酵温度在40℃时提取率最高。优选方案：发酵温度为40℃。
表2 罐内发酵温度对毛木耳多糖提取率的影响
2.2.3 发酵时间对毛木耳多糖提取率的影响
由表3可见，在酶解温度为80℃，发酵温度为40℃，其他条件不变，随着发酵时间延长，毛木耳多糖提取率先高后低，发酵时间在20 h时提取率最高。优选方案：发酵时间为20 h。
表3 发酵时间对毛木耳多糖提取率的影响
2.2.4 发酵罐压力对毛木耳多糖提取率的影响
由表4可见，在酶解温度为80℃，发酵温度为40℃，发酵时间20 h，其他条件不变，随着发酵罐压力上升，毛木耳多糖提取率先高后低，发酵罐压力维持在0.15 MPa、0.2 MPa时，毛木耳多糖提取率较高，并且不影响其他工艺。优选方案：罐内压力维持在0.15～0.2 MPa。
表4 发酵罐压力对毛木耳多糖提取率的影响
2.2.5 回流浸提时间对毛木耳多糖提取率的影响
由表5可见，在酶解温度为80℃，发酵温度为40℃，发酵时间20 h，罐内压力维持在0.15～0.2 MPa，其他条件不变，随着回流浸提时间延长，毛木耳多糖提取率先上升后下降，回流浸提时间在120 min、150 min时，提取率较高。优选方案：从能耗角度考虑优选回流浸提时间为120 min。
表5 回流浸提时间对毛木耳多糖提取率的影响
由表6可见，在酶解温度为80℃，发酵温度为40℃，发酵时间20 h，罐内压力维持在0.15～0.2 MPa，回流浸提时间120 min，其他条件不变，随着回流浸提温度上升，毛木耳多糖提取率先高后低，回流浸提温度60℃时提取率最高。优选方案：回流浸提温度为60℃。
表6 回流浸提温度对毛木耳多糖提取率的影响
2.2.7 料液比对毛木耳多糖提取率的影响
由表7可见，在酶解温度为80℃，发酵温度为40℃，发酵时间20 h，罐内压力维持在0.15～0.2 MPa，回流浸提时间120 min，回流浸提温度为60℃，其他条件不变，在料液比为1∶30～1∶50多糖提取率均高于3%，而且回流液正常。优选方案：考虑能耗与环保因素，取料液比为1∶35。
表7 料液比对毛木耳多糖提取率的影响
2.3 优选条件下毛木耳多糖提取率
以酶解时间80 min、酶解温度80℃、发酵温度40℃，发酵时间20 h，发酵压力0.15～0.2 MPa，回流浸提时间120 min，回流温度60℃，料液比为1∶35提取毛木耳多糖，重复5次。结果毛木耳多糖提取率分别为3.45%、3.43%、3.42%、3.46%、3.41%，平均值3.43%。
3 小结
单因素试验结果表明，酶解温度、发酵温度、发酵时间、罐内压力、回流浸提时间、温度以及料液比对毛木耳多糖提取率影响较大，优选条件下5次毛木耳多糖提取率较为稳定，表明该工艺较为成熟。该工艺已经进入大规模生产验证阶段。
