半乳糖凝集素- 1、 p16蛋白表达与宫颈癌患者临床特征的关系

江娜，王秀虹

咸宁市中心医院湖北科技学院附属第一医院妇科，湖北咸宁437100

宫颈癌是常见的一种妇科恶性肿瘤，其发病机制复杂[1-2]。有研究报道，p16是发现最早的可以直接参与细胞周期调控，调节细胞增殖分裂，是与细胞生长分化和恶性肿瘤细胞分裂密切相关的基因，其在多种恶性肿瘤中表达上调，且负责细胞增殖的负性调控，是细胞周期中重要的一种抑癌基因[3]。半乳糖凝集素（galectin，Gal）是人体组织细胞中富含的由1个或2个糖结构识别域组成的凝集素家族中的重要成员[4]，通过与β-半乳糖苷特异性结合可以介导细胞的黏附、增殖、凋亡和炎性反应。相关研究表明，Gal-1表达上调与恶性肿瘤细胞的侵袭性和淋巴结转移密切相关[5-6]，但目前国内外关于p16、Gal-1的表达与宫颈癌关系的研究及报道仍较少，本研究观察了宫颈癌组织中p16、Gal-1蛋白的表达情况，并对p16、Gal-1蛋白表达与宫颈癌患者临床特征的关系进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2018年12月咸宁市中心医院湖北科技学院附属第一医院收治的宫颈癌患者。纳入标准：①符合《妇产科学》第8版中宫颈癌的标准[7]；②病理学结果证实为宫颈癌；③年龄19～65岁；④既往未接受抗肿瘤放化疗或免疫性治疗；⑤病历资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤；②伴有免疫系统疾病或其他类型的宫颈疾病。根据纳入和排除标准，本研究共纳入宫颈癌患者100例，并收集患者的宫颈癌组织标本。另外，选取同期于咸宁市中心医院湖北科技学院附属第一医院接受治疗的100例宫颈上皮瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者的CIN组织为对照。100例宫颈癌患者的年龄为36～65岁，平均（48.9±8.5）岁；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期标准：I期22例，Ⅱ期28例，Ⅲ期37例，Ⅳ期13例；有淋巴结转移64例，无淋巴结转移36例；肿瘤分化程度：低分化53例，中分化27例，高分化20例；病理学类型：鳞癌61例，腺癌39例。100例CIN患者的年龄为34～65岁，平均（48.0±11.0）岁；CINI级27例，CINⅡ级46例，CIN Ⅲ级27例。

1.2 免疫组织化学染色

取宫颈癌组织和CIN组织，行二甲苯透明石蜡切片，浸泡2次；依次用100%、95%、75%、50%的乙醇梯度复水，各浸泡2 min后自来水冲洗。柠檬酸高压1.5 min修复组织抗原；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，每次3～5 min；除去PBS，向每张切片中加50 μl 3%过氧化氢，室温下孵育10 min；PBS冲洗3次，每次3 min，除去PBS；每张切片加入50 μl第一抗体的切片，室温条件下孵育60 min；PBS冲洗3次，每次3～5 min；除去PBS，接着用50 μl即用型MaxVision试剂，室温条件下孵育15 min；PBS冲洗3次，每次3 min；除去PBS，加100 μl新配制的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液，5 min后显微镜下观察；自来水冲洗后加苏木素复染再用自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后再中性树胶封固；镜下阅片、摄像；病理图像分析仪计数、采图。

1.3 免疫组织化学法评分标准

免疫组化染色的评分标准：Gal-1蛋白阳性表达为细胞质或细胞核中呈黄色、橙色、棕色甚至褐色染色；p16蛋白阳性表达为细胞质或细胞核中呈黄色、橙色、棕色甚至褐色染色。根据着色程度评分：0分，未染色；1分，仅呈淡黄色染色；2分，呈棕黄色染色；3分，呈褐色、黑色染色。根据阳性细胞所占比例评分：1分，阳性细胞所占比例≤10%；2分，阳性细胞所占比例为11%～50%；3分，阳性细胞所占比例为51%～75%；4分，阳性细胞所占比例＞75%。将染色程度与阳性细胞所占比例得分相乘，乘积＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中Gal- 1、 p16蛋白阳性表达率的比较

宫颈癌组织中Gal-1、p16蛋白的阳性表达率均明显高于CIN组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 不同组织中Gal- 1、 p16蛋白阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中Gal- 1蛋白、 p16蛋白阳性表达率的比较

FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、肿瘤分化程度为低分化的宫颈癌患者宫颈癌组织中Gal-1蛋白阳性表达率分别高于FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、肿瘤分化程度为中高分化的患者，差异均有统计学意义（χ2=6.417、4.382、6.483，P＜0.05）；肿瘤分化程度为低分化宫颈癌患者宫颈癌组织中p16蛋白的阳性表达率明显高于肿瘤分化程度为中高分化的患者，差异有统计学意义（χ2=7.868，P＜0.01）。（表2）

表2 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中Gal- 1、 p16蛋白的阳性表达情况（ n=100）

3 讨论

宫颈癌是目前对女性健康威胁最大的妇科恶性肿瘤，其病死率位于女性妇科恶性肿瘤第2位，仅次于乳腺癌。宫颈癌发生发展的机制较为复杂，与细胞周期调节失控、抑癌基因表达和细胞凋亡等均有关[8]。

p16是与细胞周期密切相关的新的抗癌基因，定位于人类染色体9p21，由3个外显子和2个内含子组成，3个外显子分别为126、307、11 bp[9-10]。p16定位于细胞核中，作为细胞周期中的基本基因和细胞周期调控蛋白，其可以参与细胞增殖的负性调节过程，阻止细胞由G1期进入S期，进而抑制细胞增殖。相关研究表明，与p53基因相比，p16是参与细胞周期调控的更重要的一种抑癌基因，其可以参与肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的直接形成[11]。p16基因是细胞周期中的刹车装置，一旦失灵细胞就会出现无限增殖，是恶性肿瘤形成的主要原因。本研究结果显示，宫颈癌组织中p16蛋白的阳性表达率明显高于CIN组织（P＜0.01），表明p16基因直接参与宫颈癌的形成过程。相关研究显示，宫颈癌患者的p16表达水平明显高于健康女性[12-13]，与本研究结论一致。本研究结果还显示，肿瘤分化程度为低分化宫颈癌患者宫颈癌组织中p16蛋白的阳性表达率明显高于肿瘤分化程度为中高分化的患者（P＜0.01），提示p16表达上调与宫颈癌进展关系密切，可作为宫颈癌病情预测的重要指标。Gal-1蛋白是哺乳动物体内参与肿瘤发生发展的重要的半乳糖凝聚素家族成员，靶向分泌至细胞质和细胞核中，通过与细胞质或细胞核中蛋白相互作用，进行细胞信号转导，同时可调控信使RNA（messenger RNA，mRNA）剪切过程进而影响细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡。相关研究表明，Gal-1蛋白在膀胱癌等多种肿瘤组织中高表达[14]。还有研究报道，结肠腺癌的基质高表达Gal-1蛋白且与肿瘤的侵袭能力、恶性程度密切相关，Gal-1蛋白高表达提示恶性肿瘤的形成[15]。本研究结果显示，宫颈癌组织中Gal-1蛋白的阳性表达率明显高于CIN组织（P＜0.01），表明Gal-1蛋白可能参与宫颈癌的发生发展过程。本研究还发现，FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、肿瘤分化程度为低分化的宫颈癌患者宫颈癌组织中Gal-1蛋白的阳性表达率分别高于FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、肿瘤分化程度为中高分化的患者（P＜0.05），表明Gal-1蛋白可能作为宫颈癌不良预后的评估指标。Gal-1蛋白参与宫颈癌侵袭、恶性转移的机制较为复杂，其中主要有以下2个方面：①上调肿瘤微血管增殖，Gal-1蛋白主要通过与神经纤毛蛋白1（neuropilin-1，NRP1）受体相结合，介导内皮细胞的黏附迁移，同时还能促进血管内皮生长因子2（vascular endothelial growth factor 2，VEGF2）受体磷酸化，进而活化有丝分裂原激活蛋白应激活化蛋白激酶1（stress-activated protein kinase 1，SAPK）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途径，促进肿瘤血管新生[16]。②增强肿瘤细胞的增殖、迁移能力，Gal-1蛋白可抑制RET、JAK2的表达，并促进肿瘤细胞增殖、迁移。

综上所述，宫颈癌组织中Gal-1、p16蛋白表达明显上调，并且与宫颈癌的恶性程度密切相关。Gal-1、p16蛋白在宫颈癌发生发展、组织分化程度等临床不良预后方面的评估价值，对宫颈癌的诊断治疗具有一定指导意义，可从分子水平推进临床对宫颈癌发生发展机制的研究。