长链非编码linc00511在卵巢癌中的表达、临床意义及预后分析

王静 王思思 马会 王萍 武欣 刘晓娟 马春星

河北北方学院附属第一医院1妇产科，2手术室（河北张家口 075000）；3河北北方学院病理教研室（河北张家口 075000）

卵巢癌是女性最致命的恶性肿瘤，其病死率远超子宫内膜癌和宫颈癌，恶性度高，预后极差。我国的统计数据显示，卵巢癌的发病率和病死率均高于欧美，且呈上升趋势，因而人群负担情况不容乐观[1]。卵巢癌早期症状隐匿，难于发现，就诊时超过70%的患者已属晚期，生存率较低，而目前对于卵巢癌的常用检测如CA125、HE4、超声等方法对于病变的早期诊断均有一定的局限性[2]，因而从分子生物学角度分析，探究其发病机制，寻求灵敏度和特异度较高的标记物成为卵巢癌诊疗新方向。

长的非编码RNA（lncRNA）一般指大于200个核苷酸，没有蛋白质编码潜功能，但却具有复杂的生物学效应。最新研究报道lncRNAs在诸多不同的生物过程中起着关键作用，包括选择性剪接，基因印迹、核内运输，细胞分化和RNA衰变等[3]。此外，lncRNAs的调节异常也被证实有助于多种类型肿瘤的发生和发展[4-5]。

linc00511是近年来发现的新的lncRNA成员，目前在乳腺癌、舌鳞状细胞癌、非小细胞癌、骨肉瘤等[6-8]肿瘤中发现其呈高表达状态，证实其能影响相应细胞株的增殖、侵袭和转移，但在卵巢癌组织中的表达水平及其功能在国内外尚未有相关文献报道。因此，本研究通过qRT-PCR法检测linc00511在卵巢癌组织中的表达水平，分析该基因与病理参数之间的关系，并积极随访，分析其与生存期的相关性，为卵巢癌的早期诊断、预后监测提供新的准确的潜在生物学指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2012年9月至2014年1月河北北方学院附属第一医院妇产科手术切除的卵巢癌组织80例、相应的癌旁正常组织80例，癌组织取自癌灶中心处，癌旁组织取自残端切缘经病理证实为正常肠组织。全部病例均为原发性肿瘤，且术前未行新辅助放化疗等针对性治疗，术后标本均在手术切除组织后1 h获得，并存于液氮中，以备使用。

1.2 主要试剂与实验方法

1.2.1 主要试剂RNA逆转录试剂购自Takara公司；SYBR Green实时定量PCR试剂盒购自美国伯乐公司；linc00511和GAPDH引物由生工生物（北京）有限公司设计合成。

1.2.2 实时定量PCR（qRT-PCR）提取总RNA：培养皿中生长状态良好的细胞用冷PBS洗3遍，加入500 μL TRIzol试剂裂解数分钟，收集到1.5 mL无酶EP管，向其中加入100 μL氯仿，室温静置3 min，12 000 r/min离心15 min，将200 μL上层液体移入新的1.5 mL EP管中，加入250 μL异丙醇，混匀，静置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，以75%乙醇溶液（含DEPC）洗涤沉淀3次（7 500 r/min离心5 min），待RNA沉淀基本透明时，加入ddH2O至充分溶解，测定RNA的质量及浓度。

按照takara RR036A试剂盒说明书逆转录合成cDNA，按照qPCR检测试剂盒通过qRT-PCR测定linc00511的表达水平，使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。人GAPDH作为内参。试验独立重复3次，应用2-ΔΔCt方法进行相对定量，其中，中位数以上为高表达，以下则考虑低表达。

1.2.3 随访定期复查、电话随访，末次随访时间为2018年12月31日，中位随访时间为37个月，22例生存，58例死亡。

1.3 统计学方法应用SPSS 18.0软件统计学分析，数据采用均数±标准差表示，linc00511与临床病理特征的关系采用χ2检验和Fisher精确概率法分析计算，应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，通过Cox回归模型分析卵巢癌患者预后的独立影响因素，P＜0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测linc00511在卵巢癌组织及癌旁细胞中表达情况qRT-PCR分析显示：与癌旁正常组织相比，linc00511在卵巢癌组织中显著高表达，差异具有统计学意义[（1.20±0.91）vs.（3.22±1.27），P＜ 0.001，图1]。

图1 qRT-RCR检测linc00511在卵巢癌和癌旁正常组织中的表达Fig.1 The expression of linc00511 in ovarian cancer and adjacent normal tissues was detected by qRT-PCR

2.2 linc00511的表达与卵巢癌患者临床病理参数的关系linc00511的高表达与卵巢癌患者分化程度、FIGO分期、淋巴结转移、CA125（+）均呈正相关（均P＜0.05），而与年龄、肿瘤大小、是否绝经等无明显相关性（均P＞0.05）。见表1。

2.3 linc00511表达与卵巢癌患者生存的相关性随访发现，linc00511高表达的54例患者中，12例生存，42例死亡，中位生存时间为25个月，linc00511低表达的26例患者中，10例生存，16例死亡，中位生存时间为33个月。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank单变量分析显示，linc00511高表达和低表达患者的生存函数比较差异有统计学意义（χ2=7.394，P=0.011），即linc00511表达和患者生存时间相关，linc00511阳性患者预后较差。见图2。

表1 卵巢癌患者不同临床病理特征与linc00511表达的关系Tab.1 Relationship between clinicopathological features and linc00511 expression in ovarian cancer例（%）

图2 生存曲线Fig.2 Suvival cure

2.4 卵巢患者独立预后因素分析Cox回归模型分析显示，linc00511表达水平（95%CI：1.307～ 2.912，P=0.001）、淋巴结转移（95%CI：1.041～ 1.620，P＜ 0.001）、分化程度（95%CI：1.725～ 2.363，P=0.035）、FIGO分期（95%CI：1.056 ～ 6.345，P=0.038）和CA125（+）（95%CI：1.160 ～ 1.741，P＜ 0.001）均是影响卵巢癌患者预后的独立因素。

3 讨论

近年来，lncRNA在肿瘤中的调控作用越来越引起广大医生的重视，并取得了重大的成果，各类lncRNAs表达的异常与肿瘤的发生和转移密切相关。目前研究较成熟的卵巢癌相关lncRNA有H19、HOTAIR、HOST2等，但对于linc00511在卵巢癌中的研究未见相关报道。linc00511长度为a2.265kb，最初发现其在侵袭性基底样乳腺癌亚型中呈高表达状态，且体外实验证实linc00511的沉默能显著乳腺癌细胞的增殖[10]。SUN等[11]应用qRT-PCR法证实linc00511在人非小细胞癌和SKMES-1、H1299、95D等多种细胞株中呈高表达状态，且随访和绘制生存曲线发现，linc00511高表达的患者预后较差，进一步研究其机制发现linc00511通过结合组蛋白甲基转移酶增强子-EZH2，调节组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）的活性，从而抑制p57的表达，诱导非小细胞癌的恶性生物学行为。MOON等[12]应用qRT-PCR法证实linc00511在舍鳞癌组织和相应细胞株中呈高表达状态，因而推测其是舍鳞癌潜在的生物学指标，进一步CCK-8实验检测发现linc00511通过竞争性结合miR-765调节致癌基因-层黏连蛋白亚基的γ2（LAMC2）的表达，从而调控肿瘤细胞的分化、增殖和转移，这一点在Nguyen的实验中亦得到了证实[13]。ZHAO 等[14]应用荧光原位杂交法证实linc00511在胰腺导管腺癌中呈高表达状态，且其表达水平与病变的不良病理特征密切相关，其高表达提示预后较差，生存期较短，考虑其机制为linc00511能通过竞争内源性RNA对hsa-miR-29b-3p的活性而上调的VEGF表达，从而促进胰腺导管癌细胞的增殖、侵袭，同时诱导肿瘤血管的生成。刘鑫等[15]应用定量PCR法检测linc00511结直肠腺癌组织和正常组织中的表达，显示linc00511在癌组织中呈高表达，明显高于正常组织，因而证实其可能是促进结直肠癌发生转移的重要原因之一，并与预后相关。

目前，国内外暂无关于linc00511在卵巢癌组织中的相关研究报道。本研究应用qRT-PCR法检测linc00511在卵巢癌和癌旁正常组织中的表达水平，结果显示其在癌细胞中的表达量均明显高于其在正常组织细胞，且linc00511的高表达与病变的分化程度、FIGO分期、淋巴结转移和CA125（+）均呈正相关，生存期随访证实linc00511高表达的卵巢癌患者生存期明显低于低表达的患者，linc00511高表达提示预后不良，Cox回归模型分析显示linc00511高表达与病变的转移、分期等病理特征均为卵巢癌患者预后的独立影响因素。

综上，linc00511在卵巢癌的发生、发展中起重要作用，其在卵巢癌的早期诊断和预后监测中具有潜在的临床应用价值，对其致癌机制的深入研究，将为卵巢癌的靶向治疗提供理论基础，这亦将是本课题今后进一步的研究方向。