阿魏酸通过抗凋亡途径改善戊四氮诱导的癫痫鼠的脑神经损伤

张淑红 张金波 刘东海 金绍静 王淑秋 朱金玲

佳木斯大学基础医学院（黑龙江佳木斯154007）

癫痫是一种常见的反复发作的慢性脑部疾病[1]，目前临床癫痫治疗主要包括抗癫痫药物治疗以及手术治疗。常用药物副作用比较小的主要是卡马西平和奥卡西平，但长期使用会导致抗药性，因此开发新的抗癫痫药物以获得更好的疗效一直倍受关注。阿魏酸（ferulic acid，FA）是一种植物内富含的酚类化学物质[2]，FA具有多效生物活性，包括抗炎、抗氧化和抗凋亡等特性[3]。FA对脑损伤、脊髓缺血和阿尔茨海默病样病理具有神经保护作用[4-5]。FA还能增加细胞色素c的稳定性，从而抑制细胞凋亡[6]。目前阿魏酸钠已在临床应用于心脑血管疾病的治疗，没有发现明显的副作用，另有研究[7]证明，FA可以减少过氧自由基诱导的海马神经细胞死亡，减少蛋白质氧化和脂质过氧化诱导的羟基自由基。2017年REN等[8]通过细胞水平和动物体内研究发现FA可通过抗氧化和抗凋亡机制对脑缺血/再灌注损伤发挥神经保护作用。目前关于FA的抗癫痫研究少见，一项研究[9]结果显示FA具有抗癫痫作用，可预防由戊四氮点燃引起的氧化应激和认知障碍。癫痫持续发作可导致患者脑神经元细胞凋亡，Bcl-2和Bax是凋亡途径的关键因子，为此本研究选择FA作为治疗癫痫的药物，探讨其在PTZ诱导的癫痫发作模型中的神经保护作用，以及FA是否通过抗凋亡途径起作用，为FA在临床的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组2017年9月15日从哈尔滨医科大学实验动物学部购置清洁级雄性Wistar大鼠[体质量（200±20）g，黑龙江省佳木斯大学实验动物中心（动物使用许可证编号为SYXK（黑）2016-014）]，房间温度为（22±2）℃，自由获取食物和水。将60只大鼠随机分成5组（n=12）：生理盐水组，大鼠仅注射生理盐水；戊四氮组（PTZ组），大鼠仅注射PTZ（35 mg/kg，腹腔注射）；低剂量FA组（25 mg/kg，腹腔注射）；中剂量FA组（50 mg/kg，腹腔注射）；高剂量FA组（100 mg/kg，腹腔注射）。低剂量FA组、中剂量FA组、高剂量FA组在注射PTZ前30 min分别注射不同浓度的FA。各组均在每日中午12时给药，连续28 d。药物浓度根据文献[10-11]选择。连续3 d Racine评分在4或5分以上的大鼠视为癫痫大鼠模型建造成功。本研究得到佳木斯大学伦理道德委员会批准（批准编号：JMSU-222）。

1.2 主要试剂FA购于上海源叶生物科技有限公司；PTZ由Sigma提供；Bcl-2和Bax等抗体购自武汉博士生物工程有限公司；245广谱蛋白Marker，10×转膜液，20×TBS购于北京索莱宝科技有限公司；BCA试剂盒、ECL化学发光液购于上海碧云天生物技术有限公司，DAB试剂盒购于北京中衫金桥生物技术有限公司；其他试剂均由分子实验室提供。

1.3 PTZ诱导的癫痫大鼠行为评估将PTZ溶解在盐水中，除生理盐水组外的大鼠均进行PTZ处理后将大鼠置于透明的笼中，观察其惊厥行为30 min。癫痫发作的潜伏期（s），癫痫持续时间（s）和癫痫发作的严重程度（根据Racine评分[12]）。如果在30 min内没有观察到癫痫发作的迹象，则最大潜伏期为1 800 s。

1.4 取材在4周结束时麻醉大鼠，然后使用0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行心脏灌注以洗掉血液。快速断头取出脑并置于冰盘上，分离两个半球。从一个半球切出海马区域并立即在液氮中冷冻以供进一步使用。将另一半球在4%多聚甲醛溶液中固定72 h，然后石蜡包埋，制备海马体的连续冠状切片（4 μm）。

1.5 Hochest33258染色法检测细胞凋亡 石蜡切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡后用枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）97℃水浴10 min。PBS洗2遍，每次3 min。加入Hoechst 33258染色液，染色5 min。去染液，用PBS洗2遍，每次3 min。滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。使用Olympus荧光显微镜观察，最后用Image pro plus6.0来测量海马神经元的凋亡率。

1.6 WesternBlot法分析Bcl-2和Bax在海马组织中的表达 取出液氮中的海马组织，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷匀浆缓冲液中匀浆，12 000 r/min离心10 min。除去上清液，稀释至等量的蛋白质（50 μg）并在95℃煮沸4 min。在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离变性蛋白质。将蛋白质转移到醋酸纤维膜上。用含3%脱脂乳的TBST液，在37℃下封闭膜90 min，再4℃下与针对Bax和Bcl-2的特异性兔多克隆抗体一起孵育过夜。通过在TBST或PBST中洗涤膜3次，每次5 min，除去过量的一抗。将1∶1 000稀释的二抗（抗兔IgG）与膜在室温下温育1 h。将膜在室温下暴露于透明度增强的化学发光试剂（ECL）2 min，并使用ChemiDocMP显现。Tanon GLS软件进行条带强度的检测和定量。

1.7 统计学方法用SPSS 17.0进行统计分析。实验数据表示为均数±标准差，采用方差同质性检验方差是否齐性，当方差齐性时，使用单因素方差检验；当方差不齐时，使用Welch方法进行比较，并将LSD用于多重比较。以P＜0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FA对癫痫发生的影响在评估时间点，与PTZ组相比，FA组的Racine评分显著降低，癫痫发作持续时间显著减少（F=76.51，P＜0.01），而癫痫发作潜伏期显著增加（F=67.86，P＜0.01），且随着药物浓度的增加显著性增强，见图1。结果表明，FA可以减少或预防自发性癫痫的发生，延长生存期。

2.2 Hochest33258染色法检测细胞凋亡 与PTZ组相比，生理盐水组大鼠的海马CA1区域没有表现出严重的神经元凋亡，统计结果显示，与PTZ组比较，FA以剂量依赖性方式降低了PTZ点燃诱导的海马神经元凋亡率（F=402.01，P＜0.01）。不同浓度的FA对PTZ致痫大鼠海马神经元凋亡的影响见图2。

图1 FA对癫痫大鼠癫痫行为的影响（n=12）Fig.1 Effect of FA on epileptic behavior in epileptic rats

图2 Hochest 33258染色法检测各组大鼠海马神经元细胞凋亡的结果Fig.2 Hochest 33258 staining method for detecting apoptosis of hippocampal neurons in each group

2.3 WesternBlot法检测海马组织中Bcl-2和Bax的表达 与PTZ组相比，生理盐水组和FA组Bcl-2蛋白表达均显著增加（F=27.66，P＜0.001）；与PTZ组相比，生理盐水组和FA组Bax蛋白表达显著降低（F=62.13，P＜0.001），且随着浓度的增加显著性增强（图3）。

3 讨论

图3 各组大鼠海马组织中Bcl-2和Bax的表达结果（n=6）Fig.3 Expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus of rats in each group

癫痫是中枢神经系统中最常见的慢性疾病，并且影响全世界至少5 000万人[13]。PTZ点燃大鼠模型模拟人类颞叶癫痫特征：海马萎缩，边缘区域神经元丢失。最近，许多科学家使用点燃模型来研究癫痫的神经生物学，并评估新疗法[14-15]和认知缺陷的有效性[16]。在各类化合物中，天然存在的酚类已引起关注，尤其是FA。许多研究[17-18]报道了FA对脑损伤、脑缺血和阿尔茨海默病样病理改变的神经保护作用，然而，FA对癫痫脑损伤的保护作用报道极少。因此，笔者研究了FA在戊四氮诱导的大鼠癫痫模型中的神经保护作用。

本研究发现FA组与PTZ组相比，Racine评分显著降低，癫痫发作显著减少。且随着浓度的增加，显著性增加。结果表明，FA有效地抑制了PTZ点燃小鼠癫痫发作的严重程度。对癫痫的发作具有明显的改善作用，与REN等[8]的研究结果一致。

Hochest 33258染色结果显示，与PTZ组相比，高、中、低剂量FA组可减轻由癫痫导致的细胞凋亡，且随着FA浓度的增加，凋亡率减低，说明FA可通过减轻细胞凋亡对细胞起保护作用。

为探讨FA抗细胞凋亡的具体途径，本研究进一步检测了细胞凋亡的相关因子Bcl-2和Bax的表达。Bcl-2家族蛋白由促进或抑制细胞凋亡的成员组成，Bax是Bcl-2基因家族的成员，与Bcl-2形成异源或同源二聚体，Bax和Bcl-2作为促凋亡调节因子和抗凋亡调节因子参与多种细胞活动。如果Bax的相对量高于Bcl-2，作为凋亡激活剂起作用，则会促进细胞死亡。相反如果Bcl-2的相对量高于Bax，从而抑制细胞凋亡。本实验结果显示，与PTZ组相比，FA组Bcl-2蛋白表达明显增加，而Bax蛋白表达明显减低，这些结果与之前的研究结果一致[19-20]。且随FA浓度增加或减低显著性增强。

本研究表明，PTZ点燃模型中FA治疗可显著降低强直-阵挛性抽搐和抽搐持续时间，延长其爆发的潜伏期，减少海马CA1区细胞凋亡以及在海马CA1区下调Bax和上调Bcl-2的表达。提示FA可能通过抗细胞凋亡从而减少神经元细胞的损失。但FA的抗凋亡机制有待进一步研究，下一步笔者将选择多个凋亡因子，探讨具体的凋亡路径。总之，本研究表明FA对PTZ诱导的癫痫脑损伤具有神经保护作用。这种保护作用可能是由抗细胞凋亡机制介导的。FA可作为预防癫痫的有效神经保护剂。