香附和醋香附HPLC 特征图谱及多元统计分析

袁 芮， 张 超，2*， 苏 彤， 杨立梅， 张学兰，2， 孙秀梅，2

（1. 山东中医药大学药学院， 山东 济南250355； 2. 国家中医药管理局中药炮制技术传承基地， 山东 济南250355）

香附为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L. 的干燥根茎, 主要含有挥发油、 黄酮、 生物碱和三萜类[1-2]。 其炮制品中, 生品和醋制品是中医临床常用的炮制规格,醋制后增强了疏肝理气、 止痛的作用, 其炮制作用的变化根源于香附醋制前后其中物质基础的变化。 现代研究比较了香附醋制前后α-香附酮[3-6]、 香附烯酮[4-6]、 圆柚酮[4-6]、 总黄酮[7]、 木犀草素[8]、 微量元素[9]等含有量的变化； 采用GC-MS 指纹图谱表征出香附挥发油的种类和质量分数在醋制前后均发生了变化[10-11], 但这些变化是否对区分生、 醋香附饮片有重大意义, 能否作为两者定性、 定量的指标, 还没有进展。 2015 年版 《中国药典》 一部香附项下[12]亦收载有香附和醋香附2 种炮制品, 两者定性和定量指标基本相同, 只是浸出物和挥发油限量稍有差别。 可见, 生、 醋香附饮片的质量评价还缺乏专属性。 若要建立能反映炮制过程的香附和醋香附质量评价标准, 可通过比较两者的特征图谱, 确定用于区分生、 醋饮片的特征峰, 从而更专属、 更准确地评价生、 醋饮片质量。

本实验收集了不同饮片企业生产的香附和醋香附饮片,分别建立相应的HPLC 特征图谱, 借助主成分分析和偏最小二乘判别分析研究香附醋制对特征图谱中色谱峰的影响,以进一步明确对区分香附和醋香附有重大意义的色谱峰,并对该色谱峰归属进行初步探讨, 以期为完善香附和醋香附的质量评价标准体系提供依据, 并为醋制类中药饮片的质量评价提供新思路。

1 材料

Agilent 1200 Series 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）； KQ-250E 型医用超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）； 电子分析天平（十万分之一, 梅特勒-托利多仪器上海有限公司）； BJ-150 型高速多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司）。

α-香附酮对照品（成都普菲德生物技术有限公司, 批号151027, 含有量≥98%）； 香附烯酮对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司, 批号X-069-170328, 含有量≥98%）； 5-羟甲基糠醛对照品（成都曼思特生物科技有限公司, 批号MUST-17021202, 含有量≥98%）； 镇江香醋（江苏恒顺醋业股份有限公司, 固态发酵）； 德馨斋清香米醋（济南德馨斋食品有限公司, 液态发酵）。 甲醇、 乙腈均为色谱纯； 水为高纯水； 其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品收集 共收集不同企业生产的香附饮片12 批、醋香附饮片13 批, 经山东中医药大学张芳副教授鉴定均为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L. 干燥根茎的炮制加工品, 信息见表1。

表1 样品信息

2.2 供试品溶液制备 取饮片粉末（过3 号筛） 0.5 g,精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇20 mL, 称定质量, 超声处理30 min, 放冷, 再称定质量, 用甲醇补足减失质量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。 精密量取0.5 mL米醋置5 mL 量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 即得米醋供试品溶液。

2.3 对照品溶液制备 分别取α-香附酮、 香附烯酮、 5-羟甲基糠醛对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成质量浓度分别为44、 48、 12 μg/mL 的对照品溶液。 分别精密量取3 种对照品溶液适量, 置同一量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 即得混合对照品溶液。

2.4 色谱条件 Intersil ODS-3 C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流动相甲醇（A） -水（B）, 梯度洗脱（0～5 min, 35% ～54%A； 5～80 min, 54% ～94%A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温25 ℃； 检测波长270 nm； 进样量20 μL。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取1 号供试品溶液, 在“2.4” 项色谱条件下连续进样6 次, 以11 号峰为参照, 测得各特征峰的相对保留时间和相对积分面积基本一致, RSD 均小于3.0%, 表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取1 号供试品溶液, 在“2.4” 项色谱条件下, 分别于0、 4、 8、 12、 16、 24 h 进样, 以11 号峰为参照, 测得各特征峰的相对保留时间和相对积分面积基本一致, RSD 均小于3.0%, 表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取同一样品6 份, 精密称定, 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.4” 项色谱条件下进样, 测得各特征峰相对保留时间和相对积分面积的RSD 均小于3.0%, 表明该方法重复性良好。

2.6 特征图谱建立 取12 批香附饮片和13 批醋香附饮片的供试品溶液, 在“2.4” 项色谱条件下进样, 将数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版处理, 色谱图见图1, 与对照图谱之间的相似度依次为0.972、 0.986、0.990、 0.985、 0.961、 0.955、 0.980、 0.955、 0.987、0.955、 0.941、 0.926； 13 批醋香附饮片色谱图见图2, 与对照图谱之间的相似度依次为0.985、 0.982、 0.967、0.980、 0.936、 0.948、 0.958、 0.908、 0.969、 0.941、0.905、 0.963、 0.945。 特征峰见图3, 其中, 峰1 为醋香附的特有峰, 其余11 个峰为共有峰。

图1 12 批香附饮片HPLC 色谱图

图2 13 批醋香附饮片HPLC 色谱图

2.7 多元统计分析 为研究香附醋炙对特征图谱中色谱峰的影响, 固定香附的产地和来源, 选取使用同一批香附药材自制的5 批香附饮片（A1～A5） 和5 批醋香附饮片（B1～B5） 进行特征图谱研究, 统计10 个样本中各自1～12 号色谱峰的积分面积, 并进行量化处理[13], 以消除取样量差异和水分含有量差异造成的影响, 结果见表2。 将量化后的峰面积数据保存为EXCEL 格式, 导入SIMCA-P （version 13.0） 软件中进行主成分分析, 见图4。 可见, 10 个样本被明显地分为2 类, 模型参数为R2X=0.663, Q2=0.706,来自于同一炮制类型的同一饮片形式被聚为了相同一类。表明醋炙对香附特征图谱中化学成分的总体特征产生了显著影响。

采用偏最小二乘判别分析对样本进行分类研究, 模型参数为R2X=0.626, R2Y=0.910, Q2=0.803, 变量对分类的重要程度可以由VIP 值的大小来衡量, VIP 值越大, 对应变量对分类的贡献就越大, 变量VIP 图见图5, 选择VIP值大于1.2 对应的色谱峰作为对分类具有重要意义的变量。峰1、 11、 6、 3 的变化对香附醋制前后饮片的区分有重大贡献, 其中, 峰1 为醋香附的特有峰, 对区分生、 醋香附饮片的贡献最大, 可作为醋香附的专属性特征标识。 醋炙后, 峰11、 6 的变化呈下降趋势, 峰3 的变化呈增加趋势,可作为生醋香附的差异性特征标识。

2.8 特征峰定性 根据相同物质在同一色谱条件下具有相近保留时间的特性, 与对照品比对初步确认其中的峰1 为5-羟甲基糠醛, 峰8 为香附烯酮, 峰11 为α-香附酮, 见图3。 实验还对5-羟甲基糠醛的来源进行了初步探讨, 发现醋香附饮片中的5-羟甲基糠醛来源于米醋, 不论是固态发酵醋还是液态发酵醋均含有5-羟甲基糠醛, 结果见图6。

图3 香附和醋香附饮片的特征峰

表2 特征峰积分面积量化处理后的数值

图4 香附和醋香附饮片主成分分析图

3 讨论

采用HPLC 对不同厂家的香附饮片和醋香附饮片进行分析, 建立HPLC 特征图谱, 且特征图谱稳定性好, 能够全面反映香附和醋香附的化学轮廓, 可作为区别于其他类中药饮片的依据。

图5 偏最小二乘判别分析VIP 得分图

图6 5-羟甲基糠醛HPLC 色谱图

借助SIMCA-P 13.0 软件研究香附醋制对HPLC 特征图谱中色谱峰的影响, 以阐述香附饮片醋制后化学成分的变化, 找出能反映香附和醋香附个性特征的色谱峰或化学物质。 主成分分析结果表明香附和醋香附的HPLC 特征图谱差异显著； 偏最小二乘判别分析结果确定醋香附的特有峰（峰1） 是对区分生、 醋香附饮片有重大意义的变量, 可作为生、 醋香附饮片专属性识别的关键指标, 归属确认峰1为5-羟甲基糠醛, 研究证实固态和液态发酵醋中均含有5-羟甲基糠醛, 与文献[14-15] 报道一致, 所以初步判断5-羟甲基糠醛来源于炮制辅料米醋。 可见, 醋香附饮片中的特有峰5-羟甲基糠醛是因醋制而产生的。 偏最小二乘判别分析结果发现醋炙后峰11、 6、 3 的量变对区分生、 醋香附饮片亦有重大意义, 归属确认峰11 为α-香附酮, 5 批自制香附饮片α-香附酮峰面积量化处理后的数值为（1 245.7±29.5）, 醋香附中α-香附酮峰面积量化处理后的数值为（1 105.9±44.9, 经SPSS 17.0 统计软件对醋炙前后α-香附酮的峰面积量化数值进行独立样本t 检验, 发现醋炙后α-香附酮含有量显著降低（P＜0.01）。 可见, α-香附酮含有量变化对区分生、 醋香附饮片有重大意义, α-香附酮的量变可作为生、 醋香附饮片的差异性特征标识, 拟在生、 醋香附饮片的质量标准中增加α-香附酮的含有量测定项, 且醋香附中α-香附酮的质控含有量应低于生香附。

本研究所建立的HPLC 特征图谱可用于香附和醋香附的质量评价和鉴别, 并提高了其专属性和准确性, 以期为醋制类中药饮片的质量评价和真伪鉴别提供借鉴。