戊己胃漂浮缓释片抗家兔胃溃疡谱效关系

卿勇军， 刘 文， 杜 平， 姚晓艳， 金 阳， 石 亚， 陈淮臣， 何 利

[1. 贵州中医药大学药学院， 贵州 贵阳550000； 2. 国药集团同济堂（贵州） 制药有限公司， 贵州 贵阳550000； 3. 贵州医科大学药学院， 贵州 贵阳550002]

戊己胃漂浮缓释片是课题组将经典名方戊己丸结合现代药用高分子材料及新制剂技术进行剂型改革, 制备的新型胃漂浮缓释制剂, 其抗炎抗胃溃疡等作用较传统戊己丸更加显著, 具有使用方便、 可定时定位释放药物的特点[1]。 中药谱效关系已广泛用于中药的药效物质基础研究[2-4], 但关于新制剂的物质基础分析相对较少。 本实验采用不同产地来源的原药材提取制备干浸膏后制备不同批次的新制剂戊己胃漂浮缓释片, 通过建立制剂的指纹图谱并比较其主要成分的差异, 同时对不同批次制剂的抗胃溃疡药效作用进行评价； 采用灰色关联度分析法[5-7]建立指纹图谱共有峰（以峰面积计） 与抗胃溃疡药效作用指标表皮生长因子（EGF） 的谱效关系模型[8-10], 最终确定其主要药效成分, 为科学阐明新制剂戊己胃漂浮缓释片的抗胃溃疡作用药效物质基础提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪、 DAD 型紫外-可见光检测器（美国安捷伦公司）； TDP-5 型单冲压片机（长沙市岳麓区中南制药机械厂）； Auy220 型电子天平（日本岛津公司）； SK8210HP 型台式超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）； HC-2062 型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）； HH-4 型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）； TB-1-1 型电子调温电热套（天津泰斯特仪器有限公司）； 酶标仪（芬兰雷勃公司）； 隔水式恒温培养箱（上海简户仪器设备股份有限公司）。

1.2 试药 对照品盐酸小檗碱（批号110713-201212）、 盐酸巴马汀 （批号110732-201309）、 盐酸药根碱 （批号110733-201108）、 吴茱萸碱（批号110802-201409）、 吴茱萸次碱（批号110801-201207）、 吴茱萸内酯（批号110800-20120）、 芍药苷（批号110736-201640）, 均购于中国食品药品检定研究院； 黄连碱（批号GZDD-0426）、 表小檗碱（批号GZDD-0833）、 芍药内酯苷（批号GZDD-0690）, 均购于贵州迪达科技有限责任公司。 乙腈（国药集团化学试剂有限公司）； 磷酸二氢钾（西陇化工股份有限公司）； 其他试剂均为分析纯。 复方丙谷胺西咪替丁片 （批号5170202, 东北制药集团沈阳第一制药有限公司）； EGF 试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司, HL20040, 96T）； 娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团）。

黄连、 吴茱萸、 白芍药材购于国内不同药材市场或者药店, 见表1, 不同产地及品种黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、 三角叶黄连Coptis deltoidea C. K.Cheng et Hsiao 或云连Coptis teeta Wall. 的干燥根茎, 吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.、石 虎 Euodia rutaecarpa （ Juss.） Ben -th. var. officinalis（Dode） Huang 或 疏 毛 吴 茱 萸Euodia rutaecarpa （Juss.）Benth. var. bodinieri （Dode） Huang 的干燥近成熟果实, 白芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根, 经贵州中医药大学周汉华教授鉴定为正品。 11 批戊己胃漂浮缓释片由本实验室制备。

表1 样品信息

1.3 动物 健康新西兰家兔, 体质量2 ～2.5 kg, 雌雄各半, 均由贵州医科大学实验动物中心提供, 实验动物生产许可证号0201602。

2 方法

2.1 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱3.06 mg、 盐酸巴马汀4.69 mg、 盐酸药根碱5.43 mg、 黄连碱4.06 mg、 表小檗碱5.38 mg、 吴茱萸内酯5.25 mg、 吴茱萸碱4.64 mg、吴茱萸次碱4.45 mg、 芍药内酯苷5.25 mg、 芍药苷4.98 mg, 分别置于10 mL 棕色量瓶中, 加甲醇至刻度, 作为对照品母液冷藏备用。 依次精密吸取各母液2.60、 2.00、0.20、 0.50、 0.60、 0.20、 0.20、 0.10、 0.68、 1.20 mL,置于同一10 mL 棕色量瓶中, 加甲醇至刻度, 即得, 冷藏备用。

2.2 供试品溶液制备 取11 批戊己胃漂浮缓释片适量,充分研磨, 分别精密称取0.1 g, 置具塞锥形瓶中, 分别精密加入25 mL 甲醇, 称定质量, 超声提取30 min, 放冷,甲醇补足减失的质量, 摇匀, 过0.45 μm 微孔滤膜, 取续滤液, 即得。

2.3 色谱条件 Agilent ZORBAX 色 谱 柱 XDB-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流动相乙腈（A） -KH2PO4溶液（B）, 梯度洗脱, 程序见表2； 体积流量1 mL/min； 柱温30 ℃； 进样时间55 min； 检测波长225 nm； 进样量10 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.4 抗胃溃疡药效指标考察

2.4.1 胃溃疡模型及给药 除正常对照组外的各组家兔均灌胃70%乙醇-0.15 mol/L 盐酸混合溶液以诱导家兔产生胃溃疡[11-12], 以1 mL/kg 剂量灌胃相应体积混合液。 将家兔随机分为以下14 组： 对照组、 模型组、 阳性组（丙谷胺西咪替丁片）、 11 个给药组, 每组6 只, 雌雄各半。

家兔造模后第2 天, 各给药组给予相应受试药物12 d,正常对照组和模型组给予等量生理盐水, 戊己胃漂浮缓释片按人体剂量（以60 kg 计） 换算为0.400 g/kg； 阳性组为0.027 g/kg, 其间正常喂予由动物提供中心配送的标准饲料。

2.4.2 血清及胃组织液中EGF 检测 家兔治疗结束后,禁食不禁水24 h, 采用5 mL 注射器于家兔耳中央动脉取血（取血前先剔除家兔耳中央动脉血管周围部分毛发, 然后使用酒精棉反复擦拭或用手指反复来回按摩, 使血管扩张,缓慢拉动抽取, 避免溶血） 约5 mL, 放置于10 mL 离心管中, 室温静置20 min 左右, 待离心管上端有血清液分层析出时, 即可转移至离心机中离心血液。 家兔取血完成后,采用空气栓塞法处死, 剪取胃溃疡瘢痕周围组织约0.3 g,正常组取同一部位组织, 用适量生理盐水制成10%组织匀浆液, 两者均以10 000 r/min 转速离心10 min, 移液器吸取上清液, 留样检测。

2.5 数据处理 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A 版软件处理图谱数据, SPSS16.0 软件进行数据分析,各组计量数据资料以示, 当资料满足正态分布且组间方差齐时, 选用单因素方差分析进行处理； 如不满足上述条件, 则采用非参数检验, 即秩和检验, 数据按α=0.05 为检验水准。 P＜0.05 表示差异显著, P＜0.01 表示差异极显著。

3 结果

3.1 指纹图谱建立 取11 批戊己胃漂浮缓释片, 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.3” 项色谱条件下进样, 将色谱图导入相似度评价系统分析软件, 共确定16 个共有峰, 色谱图见图1, 共有模式叠加图见图2。 并对共有峰进行定性分析, 结合对照品和文献信息, 结果见表3。

图1 各成分HPLC 色谱图

图2 11 批样品HPLC 指纹图谱

3.2 EGF 检测 由表4 可知, 模型组大鼠血清及胃组织匀浆液中EGF 水平明显较高, 与对照组比较差异显著（P＜0.01）； 11 个给药组均能不同程度降低大鼠血清及胃组织匀浆液中EGF 水平, S1、 S2、 S3、 S9、 S10 效果较好, 与模型组和对照组比较均差异显著（P＜0.01）。

表3 11 批样品峰面积

表4 各组EGF 水平比较（ng/mL， n=6）

表4 各组EGF 水平比较（ng/mL， n=6）

注：与模型组比较,△△P＜0.01；与对照组比较,**P＜0.01

images/BZ_238_236_2295_1194_2353.png对照组 2 201.23±7.08△△ 2 659.71± 26.77△△模型组 4 694.00±32.96** 4 608.21±15.16**阳性组 3 018.40±12.49△△** 2 827.17±27.19△△**S1 组 3 219.24±21.76△△** 3 451.16±14.21△△**S2 组 2 853.92±19.19△△** 3 415.34±9.16△△**S3 组 3 009.57±13.23△△** 3 152.04±10.52△△**S4 组 3 442.29±17.37△△* 3 585.29±16.76 S5 组 3 953.18±37.72 3 611.94±47.43 S6 组 3 630.10±20.56 3 138.66±34.67△△**S7 组 3 232.33±15.69△△ 3 473.46±12.64△△**S8 组 3 810.45±48.45 3 183.67±24.91△△**S9 组 3 352.85±10.42△△** 3 352.81±12.60△△**S10 组 2 907.11±11.26△△** 3 464.91±26.54△△**S11 组 3 961.21±19.25 3 831.29±10.13

3.3 灰色关联分析

3.3.2 谱效关系 按关联度大小进行排序, 见表5, 可知指纹图谱中共有峰峰面积与抗胃溃疡作用药效指标表皮生长因子 （EGF） 的降低有高度关联性, 关联度均大于0.550 0。 各色谱峰对药效指标EGF 促进作用的贡献依次为13＞6＞8＞10＞15＞7＞9＞12＞4＞14＞16＞1＞5＞11＞3＞2, 其中13号峰（盐酸小檗碱）、 6 号峰（芍药苷）、 8 号峰（表小檗碱）、 10 号峰（黄连碱）、 15 号峰（吴茱萸碱） 关联度均在0.750 0 以上, 表明戊己胃漂浮缓释片抗胃溃疡是通过有效组分群共同发挥药效作用。

表5 关联度测定结果

灰色关联分析发现, 5 种药效成分对抗胃溃疡作用的贡献程度最大, 提示接下来研究的重点方向应为制剂体内药效成分作用规律及机制[14], 实现离体与在体实验相补充、 微观与宏观相结合, 建立更加符合科学理论的药效筛选及评价体系, 为制剂抗胃溃疡作用机制与药效物质基础研究开辟新的道路。

4 讨论

已有研究表明[15-16], EGF 具有抑制胃酸、 胃蛋白酶的分泌, 降低其对黏膜的损伤, 抑制胃黏膜细胞凋亡, 维持黏膜完整性的作用； 增加胃黏膜的血流量, 促进血管生成、结缔组织再生、 黏膜分泌重碳酸盐, 保护胃黏膜免受损伤因子破坏； 增加上皮细胞的合成, 促进胃黏膜损伤修复和溃疡愈合, 减少溃疡复发, 是抗炎、 抗胃溃疡作用的重要机制之一[17-18]。

本实验对11 批戊己胃漂浮缓释片进行了HPLC 指纹图谱分析, 确定了16 个共有峰, 明确了其中10 个所代表的化学成分, 可较好表征制剂成分的信息。 采用灰色关联分析方法建立了共有色谱峰与抗胃溃疡药效之间的谱效关系,表明各共有峰与抗胃溃疡作用均有不同程度的关联性, 关联度在0.598 7～0.832 6 之间, 其中盐酸小檗碱、 芍药苷、表小檗碱、 黄连碱、 吴茱萸碱抗胃溃疡作用关联度较强,进一步明确了制剂谱效关系, 为相关效物质基础研究提供参考依据。