茜花胶囊对急性痛风性关节炎大鼠症状和炎症的影响

黄 锐， 袁 毅， 袁 渊， 任桂林， 李 志， 钟振东， 蒲清荣*

（1. 西南医科大学附属中医医院， 四川 泸州646000； 2. 成都里来生物科技有限公司， 四川 成都610000）

急性痛风性关节炎是由嘌呤代谢异常致使单钠尿酸盐结晶沉积到关节及其周围组织, 诱使相关炎症细胞聚集到关节周围发生吞噬反应, 从而引起关节周围广泛的炎症反应, 为成年男性常见的炎性关节疾病之一[1-2]。 在急性发作期, 病变关节红肿疼痛剧烈, 滑膜炎性细胞浸润、 表面充血水肿、 组织局部坏死, 在关节积液和周围组织中炎症因子如肿瘤坏死因子-α （TNF-α） 和白细胞介素-1β （IL-1β）等均显著增高[3]。 目前, 临床上治疗急性痛风性关节炎的常用药物秋水仙碱、 非甾体类消炎药、 糖皮质激素虽然疗效较好, 但易产生严重的不良反应[4-5], 故寻找相关中成药越来越引起人们的重视。

茜花胶囊是治疗痛风的经验方, 由茜草、 花椒、 通草组成, 具有凉血散瘀、 通络止痛、 清热利尿的功效, 主要用于痛风引起的关节或肌肉的红、 肿、 热、 痛、 麻等症[6-7], 疗效较好, 但其具体抗炎机制尚不清楚。 因此, 本试验初步探讨茜花胶囊在尿酸钠诱导大鼠急性痛风性关节炎中的抗炎作用, 从而为该制剂相关研究奠定基础。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠40 只, 雄性, 体质量280 ～320 g, 由西南医科大学实验动物中心提供, 动物合格证号SCXK（川） 2013-17, IVC 系统喂养[实验动物使用许可证SYXK（川） 2013-065], 自由进食进水。 本实验所涉及动物相关操作均在西南医科大学动物伦理委员会批准下进行。

1.2 试药 茜花胶囊（西南医科大学附属中医医院制剂室, 批号20160522）。 别嘌醇（黑龙江澳利达奈德制药有限公司, 批号15120903）； 尿酸钠（美国Sigma 公司, 批号U2875）。 大鼠TNF-α （货号xl-Er0359）、 IL-1β （货号xl-Er0187） ELISA 试剂盒（英国Abcam 公司, 鑫乐生物进口分装）； 尿酸测定试剂盒（江西特康科技有限公司, 批号1703103）。

1.3 仪器 Multlskan Mk3 型酶标仪[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]； RM2016 转轮式切片机 （德国Leica 公司）； BA400 Digital 数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）； TC6010L 型全自动生化分析仪（江西特康科技有限公司）。

2 方法

2.1 尿酸钠溶液制备[8]尿酸钠用PBS 配制成20 mg/mL溶液, 超声振荡充分溶解, 使用前180 ℃下灭菌2 h,即得。

2.2 造模及给药 40 只大鼠适应性喂养1 周后, 随机分为正常组、 模型组、 别嘌醇组（3.5 mg/kg）[9]、 茜花胶囊组（1.666 9 g/kg）, 每组10 只。 给药组大鼠每天灌胃给予对应药物, 正常组、 模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水,每天1 次, 持续14 d, 于第12 d 给药后1 h 开始建模。 除正常组外, 各组大鼠乙醚麻醉, 选取右膝关节作为穿刺点,穿刺者用左手拇指扪及髌骨外侧缘与股骨外侧踝之间的髌骨关节间隙, 右手持1 mL 注射器缓慢穿刺进针, 有脱空感后回抽出少许关节液, 注入0.2 mL 单钠尿酸盐溶液, 以关节囊对侧鼓起为注射成功标准, 诱导急性关节炎模型； 正常组大鼠对应位置注入等量生理盐水。

2.3 指标检测

2.3.1 肿胀指数[10]通过2 ～3 mm 宽纸条和游标卡尺测量造模前后1、 2、 4、 8 h 关节周径, 计算关节肿胀指数,公式为肿胀指数= [（测定时间点关节周径-初始周径） /初始周径] ×100%。

2.3.2 TNF-α、 IL-1β、 UA 水平检测 造模48 h 后, 大鼠开腹下腔静脉取血3 mL, 保存于普通真空采血管中, 静置0.5 h, 4 000 r/min 离心10 min, 取血清分装于1 mL 离心管中, -70 ℃下保存。 ELISA 法检测TNF-α、 IL-1β 水平,尿酸测定试剂盒检测尿酸水平。

2.3.3 膝关节组织病理变化 造模48 h 取血后取大鼠膝关节, 4%多聚甲醛固定, 5.5% EDTA 溶液脱钙, 常规脱水, 透明, 包埋, 切片, HE 染色, 观察大鼠膝关节滑膜组织形态变化。

2.4 统计学分析 通过SPSS 12.0 软件进行处理, 数据以） 表示, 组间数据比较采用单因素方差分析, 方差齐采用LSD 检验, 方差不齐采用Tamhane’s T2 检验。 P ＜0.05 差异有统计学意义。

3 结果

3.1 茜花胶囊对大鼠关节肿胀的影响 表1 显示, 与模型组比较, 茜花胶囊组大鼠造模4、 8 h 后关节肿胀指数显著降低（P＜0.05）。

表1 茜花胶囊对大鼠关节肿胀的影响， n=10）

表1 茜花胶囊对大鼠关节肿胀的影响， n=10）

注：与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

images/BZ_223_236_2532_2244_2631.png模型组 — 28.11±3.6 45.57±4.8 40.57±6.4 30.48±5.8别嘌醇组 3.5 24.64±6.4 35.15±6.2 23.16±3.7** 11.37±3.8**茜花胶囊组 1 666.9 25.01±8.3 39.21±4.5 26.35±5.5* 19.22±6.8**

3.2 茜花胶囊对大鼠膝关节滑膜组织病理变化的影响 图1 显示, 正常组大鼠关节面光滑平整, 滑膜组织正常； 模型组大鼠关节面不平整, 偶见表面结缔组织浸润生长, 细胞排列较为紊乱, 部分软骨细胞发生变性坏死, 可见多重潮线, 软骨下骨小梁排列规律, 滑膜组织较为正常, 其中8 例可见滑膜组织细胞轻度增生, 滑膜内不同程度的纤维组织增生, 7 例可见滑膜内不同程度的炎细胞浸润, 以中性粒细胞浸润为主, 其中3 例有少量巨噬细胞增多, 其他无明显病理变化； 别嘌醇组大鼠关节面不平整, 细胞排列较整齐, 结构清晰, 滑膜组织细胞、 纤维细胞有不同程度增生, 滑膜内少量中性粒细胞浸润； 茜花胶囊组大鼠关节面光滑平整, 细胞排列较为整齐, 结构清晰, 滑膜组织细胞轻度增生, 滑膜内少量中性粒细胞浸润。

图1 各组大鼠膝关节滑膜组织病理变化（HE， ×400）

3.3 茜花胶囊对UA、 TNF-α、 IL-1β 水平的影响 表2 显示, 与正常组比较, 模型组UA、 TNF-α、 IL-1β 水平显著升高（P＜0.05）； 与模型组比较, 茜花胶囊组UA、 IL-1β水平显著降低（P＜0.05）, 但TNF-α 水平无明显变化（P＞0.05）。

表2 茜花胶囊对UA、 TNF-α、 IL-1β 水平的影响， n=10）

表2 茜花胶囊对UA、 TNF-α、 IL-1β 水平的影响， n=10）

注：与正常组比较,*P＜0.05；与模型组比较,△P＜0.05

images/BZ_224_236_2116_2244_2166.png正常组 — 59.80±9.13 161.04±8.65 14.14±1.32模型组 — 110.11±11.03* 182.52±10.97* 16.49±1.10*别嘌醇组 3.5 75.50±12.15*△ 171.54±7.52*△ 15.06±1.23△茜花胶囊组 1 666.9 84.00±9.50*△ 177.11±11.69* 15.04±1.23△

4 讨论

TNF-α、 IL-1β 等炎症因子在急性痛风性关节炎发生发展中发挥着重要作用[11], 并且UA 也是判断痛风的重要临床指标, 故本实验选择三者作为检测指标。 结果表明, 茜花胶囊可快速改善急性痛风性关节炎大鼠关节肿胀, 减轻炎细胞浸润、 巨噬细胞增生、 滑膜组织增生、 纤维组织增生等病变程度, 有效抑制UA、 IL-1β 水平升高。

目前, 急性痛风性关节炎模型建立方法一般采用大鼠踝关节注射给药[12-14], 以及小鼠、 家兔后肢膝关节注射给药[15]。 课题组前期选择大鼠右踝关节注射给药, 但其关节腔较小, 药物易溢出腔内, 导致造模不成功, 而且雌鼠对尿酸代谢的自愈性较强。 因此, 本实验选择雄鼠进行造模,右膝关节注射单钠尿酸盐, 即穿刺者用左手拇指扪及髌骨外侧缘与股骨外侧踝之间的髌骨关节间隙, 右手持1 mL 注射器缓慢穿刺进针, 有脱空感后回抽出少许关节液, 打入药物, 这是造模成功的关键。

膝关节腔注射药物造模时对关节面损伤较大, 故只适用于局部关节症状观察。 造模48 h 后取血时, 关节中未见尿酸盐结晶, 国外文献[16-17] 报道分别是4、 6 h 后取血, 但也未见尿酸盐结晶, 国内大多文献也未涉及。 结合本实验结果, 推测茜花胶囊可能具有拮抗尿酸盐在关节腔沉积的作用, 但其是否与该制剂中某些有效部位群有关,作用机制有哪些尚不明确, 还需进一步研究。