克癀胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠的影响

周艾强， 关卫兵， 王凤林， 李 理*， 纪翠芳， 杨宏志， 谢英华， 章明敏

（1. 广州市花都区人民医院， 广东 广州510800； 2. 中山大学附属第三医院， 广东 广州510630；3. 海口市人民医院， 海南 海口570208； 4. 深圳同安药业有限公司， 广东 深圳518000）

近年来随着生活水平提高、 饮食结构改变, 非酒精性脂肪肝发病率迅速增加, 而且发病年龄日趋年轻化, 其中我国为6.3% ～27.0%[1], 已超过病毒性肝炎成为第1 大肝病[2], 严重危害了人民健康。 脂肪肝是一种由多种病因引起的肝脏脂质超过肝湿重3%, 或组织学上30% 以上肝细胞脂肪变性的病理状态[3], 治疗方法除了提倡平衡饮食、适量运动外, 目前临床上采用调脂、 抗氧化, 但效果不理想； 中药因其多靶点、 多途径的特色, 在防治脂肪肝方面取得了显著疗效[4-5]。

克癀胶囊由三七、 黄连、 黄芩、 黄柏、 大黄、 人工牛黄、 人工麝香等组成, 并经红曲发酵制备, 具有清热解毒、化瘀散结的功效, 临床用于湿热毒邪内蕴、 瘀血阻络证及急慢性肝炎[6], 对非酒精性脂肪肝具有一定疗效。 为进一步了验证克癀胶囊药理作用, 本实验探讨该制剂对非酒精性脂肪肝大鼠的影响。

1 材料

1.1 试药 克癀胶囊（深圳市同安药业有限公司, 批号171003、 180103）； 水飞蓟宾胶囊（阳性对照药1, 天津天士力圣特制药有限公司, 批号750604050、 750603024）； 多烯磷脂酰胆碱胶囊[阳性对照药2, 赛诺菲（北京） 制药有限公司, 批号7BJD031B、 7BJD039B], 实验时均以纯化水配至所需浓度的混悬液。 总胆固醇 （TCH） （批号MS8115）、 甘油三酯（TG） （批号MS8233）、 高密度脂蛋白胆固醇（HDL） （批号MS8247）、 低密度脂蛋白胆固醇（LDL） （批号MS8327） 检测试剂盒（宁波美康生物科技有限公司）。 丙二醇、 丙酮（广州化学试剂厂）； 吐温80（天津市大茂化学试剂厂）； 胆固醇（河南一品食化有限公司）； 猪胆盐 （广东环凯微生物科技有限公司, 批号3206086）； 蛋黄粉、 纯化水（自制）。

1.2 仪器 UW620H、 TW423L 电子天平 （日本岛津公司）； GL224-1SCN 电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]； MP12001 电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）； BCD-290 W 普通冰箱（青岛海尔股份有限公司）； T18 匀浆机（德国IKA 公司）； Dimension Xpand Plus西门子全自动生化分析仪（德国西门子公司）； Excelsior AS 自动组织脱水机、 GEMINI AS 全自动染色机、 HM340E转轮式切片机 （美国Thermo 公司）； KD-BM Ⅱ包埋机、KD-PI 电脑生物组织摊片机、 KD-H 烘片机（烤片机） （浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）； QCT-1800 病理取材台（苏净安泰空气技术有限公司）； Axio Lab. A1 显微镜（德国ZEISS 公司）； BM-30 生物显微镜（上海光学仪器六厂）； DGX-9073B 电热恒温鼓风干燥箱（上海南荣实验室设备有限公司）； SONY DSC-RX100 数码照相机[索尼数字产品（无锡） 有限公司]。

1.3 动物 SPF 级SD 大鼠80 只, 雄性, 体质量153.6 ～184.3 g, 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供； 实验动物质量合格证号43004700039669, 实验动物生产许可证号SCXK （湘） 2016-0002。 大鼠接收后进行检疫及适应性观察, 每天1 次, 连续3～4 d, 包括一般精神状态、 皮毛、活动情况等, 观察无异常后开始实验。

2 方法

2.1 高脂饲料、 乳剂制备 高脂饲料由10%猪油+10%蛋黄粉+1%胆固醇+5%蔗糖+0.2%胆盐+73.8%基础饲料组成,高脂乳剂由20 g 花生油+20 g 猪油+15 g 胆固醇+3 g 猪胆盐+5 mL 吐温-80+5 mL 丙二醇+蒸馏水适量, 定容至100 mL。造模开始1 ～4 周高脂乳剂灌胃, 剂量按2.5、 5、 7.5、10 mL/kg每周递增, 造模第5、 6 周为10 mL/kg, 每天1 次。

2.2 给药剂量配制 克癀胶囊给药剂量配制方法见表1,水飞蓟宾胶囊、 多烯磷脂酰胆碱胶囊给药剂量分别为35 mg/kg、 0.14 g/kg （均为成人剂量的1 倍）。

表1 克癀胶囊给药剂量配制方法

2.3 模型建立 80 只大鼠取10 只作为阴性对照组, 给予SPF 大鼠生长繁殖饲料加纯化水灌胃； 其余70 只给予高脂饲料喂养6 周, 并且每天灌胃高脂乳剂1 次, 第1～4 周剂量按2.5、 5、 7.5、 10 mL/kg 每 周 递 增, 第5 ～6 周 为10 mL/kg, 建立非酒精性脂肪肝大鼠模型。 造模期间, 因灌胃操作失误死亡10 只大鼠, 因体质量不合格淘汰6 只造模大鼠, 其余造模成功大鼠按体质量区间法随机分为6 组,每组9 只, 分别为模型组、 水飞蓟宾胶囊组、 多烯磷脂酰胆碱胶囊组及克癀胶囊高、 中、 低剂量组（1.51、 0.76、0.38 g/kg）。 另外, 阴性对照组大鼠因体质量不合格淘汰1 只。

造模后, 阴性对照组、 模型组大鼠给予纯化水, 其余各组大鼠每天灌胃给予相应药物1 mL/100 g, 连续14 d,每天1 次, 给药期间所有大鼠给予SPF 大鼠生长繁殖饲料和正常饮水。 各组给药方案见表2。

表2 各组给药方案（n=9）

2.4 指标检测

2.4.1 体质量、 一般状况 实验期间, 每天观察大鼠状态； 造模期间, 每周测量大鼠体质量1 次； 给药时, 每3 d测量大鼠体质量1 次。

2.4.2 肝组织、 血清生化指标 末次给药后, 大鼠禁食不禁水16 h, 第2 天腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉, 腹主动脉取血 5 mL, 采血后静置 30 min,3 000 r/min离心10 min, 收集血清, 检测TCH、 TG、 HDL、LDL 水平。 再称取肝组织0.2 g, 加入9 倍量乙醇-丙酮（1 ∶1） 制成100 g/L 肝匀浆, 3 000 r/min 离心10 min, 取上清液, 检测TCH、 TG 水平。

2.4.3 肝指数 取大鼠肝脏, 称定湿重, 计算肝指数=（肝脏湿重/体质量） ×100%。

2.4.4 肝组织病理变化 切取大鼠肝右叶组织, 置于10%中性福尔马林中固定, 常规石蜡包埋, 切片, HE 染色, 进行病理分析。 检查标准[7]见表3。

表3 大鼠肝组织病理变化检查标准

2.5 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理, 数据以） 表示, 多组间比较采用单因素方差分析； 组间均数两两比较时, 方差齐采用LSD 法, 方差不齐采用Dunnett’s T3 法, α=0.05 或0.01。 P＜0.05 差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般状况 大鼠毛发整洁光泽, 行动灵活, 饮食饮水正常, 排泄物正常, 未见异常。

3.2 大鼠肝指数 表4 显示, 与阴性对照组比较, 模型组大鼠肝指数显著增加（P＜0.01）； 与模型组比较, 克癀胶囊中剂量组大鼠肝指数显著降低（P＜0.01）。

表4 各组大鼠肝指数比较， n=9）

表4 各组大鼠肝指数比较， n=9）

注：与阴性对照组比较,**P＜0.01；与模型组比较,▲▲P＜0.01

images/BZ_220_236_2265_1194_2315.png阴性对照组 2.550±0.069模型组 3.312±0.160**克癀胶囊高剂量组 3.252±0.352克癀胶囊中剂量组 2.997±0.261▲▲克癀胶囊低剂量组 3.140±0.274水飞蓟宾胶囊组 3.000±0.251▲▲多烯磷脂酰胆碱胶囊组 2.988±0.103▲▲

3.3 大鼠肝组织指标 表5 显示, 与阴性对照组比较, 模型组TCH、 TG 水平显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较,克癀胶囊中剂量组TCH 水平显著降低（P＜0.05）。

表5 各组大鼠血脂指标比较 n=9）

表5 各组大鼠血脂指标比较 n=9）

注：与阴性对照组比较,**P＜0.01；与模型组比较,▲P＜0.05

images/BZ_220_1284_1849_2242_1899.png阴性对照组 1.140±0.137 0.817±0.143模型组 1.621±0.122** 1.103±0.127**克癀胶囊高剂量组 1.515±0.102 1.223±0.290克癀胶囊中剂量组 1.447±0.177▲ 1.041±0.222克癀胶囊低剂量组 1.539±0.099 1.087±0.188水飞蓟宾胶囊组 1.568±0.078 1.168±0.181多烯磷脂酰胆碱胶囊组 1.498±0.183 1.090±0.182

3.4 大鼠血清指标 表6 显示, 与阴性对照组比较, 模型组TCH、 LDL 水平显著升高（P＜0.05, P＜0.01）, HDL 水平显著降低（P＜0.01）； 与模型组比较, 克癀胶囊高、 中剂量组TCH 水平显著降低（P＜0.01）, 各剂量组LDL 水平显著降低（P＜0.05, P＜0.01）。

表6 各组大鼠血清指标比较（±s， n=9）

表6 各组大鼠血清指标比较（±s， n=9）

注：与阴性对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与模型组比较,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01

images/BZ_220_236_2745_2244_2795.png阴性对照组 1.694±0.203 0.598±0.193 0.592±0.075 0.387±0.042模型组 2.048±0.322* 0.571±0.178 0.476±0.103** 0.554±0.093**克癀胶囊高剂量组 1.609±0.323▲▲ 0.745±0.271 0.447±0.075 0.422±0.094▲▲克癀胶囊中剂量组 1.603±0.091▲▲ 0.622±0.203 0.460±0.053 0.421±0.046▲▲克癀胶囊低剂量组 1.801±0.319 0.722±0.205 0.504±0.067 0.461±0.092▲水飞蓟宾胶囊组 1.647±0.242▲▲ 0.668±0.165 0.476±0.047 0.436±0.086▲多烯磷脂酰胆碱胶囊组 1.776±0.267 0.606±0.100 0.469±0.058 0.497±0.092

3.5 大鼠肝组织病理变化 图1 显示, 阴性对照组大鼠肝细胞未见明显脂肪变性（＜5%）； 模型组大鼠可见较明显的肝细胞脂肪变性（＞50%）, 肝小叶内点状坏死、 少量炎细胞浸润； 克癀胶囊组、 水飞蓟宾胶囊组、 多烯磷脂酰胆碱胶囊组组大鼠肝细胞脂肪变性程度较模型组有不同程度减轻, 小叶内可见点状坏死灶。 分级汇总见表7。

图1 各组大鼠肝组织病理变化（HE， ×100）

表7 大鼠肝组织病理变化分级汇总（n=9）

表8 显示, 与阴性对照组比较, 模型组大鼠肝脏病理学诊断评分显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较, 克癀胶囊中剂量组评分显著降低（P＜0.05）。

表8 大鼠肝脏病理学诊断评分s， n=9）

表8 大鼠肝脏病理学诊断评分s， n=9）

注：与阴性对照组比较,** P ＜0.01；与模型组比较,▲P ＜0.05,▲▲P＜0.01

阴性对照组 0.22±0.44模型组 4.44±0.73**克癀胶囊高剂量组 3.89±1.27克癀胶囊中剂量组 3.33±1.00▲克癀胶囊低剂量组 3.44±1.01水飞蓟宾胶囊组 2.33±1.50▲▲多烯磷脂酰胆碱胶囊组 3.56±1.24

4 讨论

本实验设计了克癀胶囊低、 中、 高3 个剂量组, 分别相当于成人临床等效剂量的0.5、 1、 2 倍, 发现1 倍剂量时疗效最佳； 2 倍剂量疗效低于1 倍剂量, 但优于0.5 倍剂量, 可能与给药浓度过高有关, 导致药物未经大鼠胃肠道充分吸收即排出体外, 不能充分发挥作用。 剂量对疗效发挥有着重要影响, 本实验发现克癀胶囊治疗非酒精性脂肪肝时存在最佳服用剂量, 超过一定剂量后疗效与其不呈正比关系, 这对进一步指导临床用药, 把握其最佳治疗窗阈具有重要指导意义。 同时, 最佳剂量给药方案经济成本效益最高, 有利于减少医疗资源浪费, 为临床合理用药提供依据。

中医将非酒精性脂肪肝归于“肝癖” “胁痛” “积聚”“痰证” “瘀证” 等范畴, 认为痰、 湿、 浊、 瘀、 热为其主要病理因素[8]。 克癀胶囊药性和缓不伤正, 是治疗湿热毒邪内蕴、 瘀血阻络证、 急慢性肝炎等疾病的传统中药, 方中三七活血化瘀, 消肿定痛, 具有降血脂、 降血糖、 清除自由基、 抗炎、 抗氧化[9]等药理作用, 其活性成分三七皂苷有着改善血液循环、 增加机体免疫力、 抗炎、 抗衰老、护肝等多种生理活性[10-11], 可提高肝组织及血清超氧化物歧化酶（SOD） 水平, 减少肝糖原消耗, 改善肝微循环,减轻线粒体、 内质网等细胞器损伤及肝纤维化[12]； 黄连具有抑制肝脏细胞内脂质的合成等作用, 可减少肝脏对脂质的储存[13-14]； 黄芩具有降低血脂、 肝脂质水平、 增强机体抗氧化能力[15]； 红曲是以大米为原料, 经红曲霉发酵而成的一种紫红色米曲, 其所含洛伐他汀可抑制体内胆固醇合成, 具有显著的降血脂功能[16], 各组分具有保肝降脂的协同作用, 可能是中药复方多成分、 多靶点协同增效的机理。目前临床治疗非酒精性脂肪肝的药物, 如贝特、 他汀类等在降脂的同时存在一定肝毒性[17], 这与临床上保肝降脂的目的存在矛盾, 故克癀胶囊这一传统保肝降脂中药显示了优势。

综上所述, 克癀胶囊能显著降低非酒精性脂肪肝大鼠血清TC、 LDL 水平, 明显缓解肝细胞脂肪变性, 减轻肝脏质量, 降低肝指数, 保护肝功能, 表现出良好的防治作用,可为该制剂临床应用提供实验依据。