麸煨诃子不同部位抗溃疡性结肠炎的谱效关系

温聪聪， 鞠成国， 张 强， 贾 茹， 王 巍

（辽宁中医药大学药学院， 辽宁 大连116600）

诃子收载于2015 年版《中国药典》 一部, 为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz. 或绒毛诃子Terminalia chebula Retz. var. tomentella Kurt.的干燥成熟果实, 具有涩肠止泻、 敛肺止咳之功效[1]。 在藏蒙医学中诃子应用非常广泛[2], 其地位相当于中药方剂中的甘草[3]。 传统医学中, 诃子存在生熟异用, 《本经逢原》 中有“生用清金止嗽, 煨熟固肠止泻” 的记载。 诃子煨后主治久泻、痢疾、 肠风、 泻血, 即中医的“肠澼”, 在现代临床上与溃疡性结肠炎相对应[4]。 本实验以溃疡性结肠炎动物模型为对象, 对诃子煨后固肠止泻药效物质进行研究, 比较灌胃给予水提部位、 正丁醇部位、 乙酸乙酯部位后药效学指标的差别, 确定有效部位。 并采用HPLC 分别建立麸煨诃子水提部位、正丁醇部位、 乙酸乙酯部位的指纹图谱, 利用灰色关联分析法建立共有指纹峰与药效指标之间的关系, 筛选对药效贡献较大的特征峰, 为明确诃子煨后固肠止泻的炮制原理提供理论基础。

1 材料

安捷伦1100 高效液相色谱系统（美国Agilent公司）； FA1004B 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）； 台式高速微量离心机（湖南可成仪器设备有限公司）； FSH-2A 可调高速匀浆机（常州市国旺仪器制造有限公司）； Multiskan Mk 3 型酶标仪（赛默飞世尔上海仪器有限公司）。

10 批诃子药材经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为正品, 信息见表1。 柳氮磺胺吡啶肠溶片（批号H31020840, 上海福利达制药有限公司）；没 食 子 酸 （批 号17010103）、 鞣 花 酸 （批 号17031010） 均购于成都曼斯特生物科技有限公司。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

小鼠丙二醛 （MDA）、 超氧化物歧化酶（SOD）、 白细胞介素1β （IL-1β）、 白细胞介素10（IL-10）、 肿瘤坏死因子α （TNF-α） 试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司, 批号分别为20171014TT、 20171014HF、 20171014HS、20171014GP、 20171014JA）； 甲醇为色谱纯； 水为纯净水； 乙酸乙酯、 正丁醇、 冰乙酸、 磷酸均为分析纯（天津科密欧化学试剂有限公司）。

SPF 级小鼠, 体质量18 ～22 g, 购于辽宁长生生 物 技 术 有 限 公 司, 批 号 为 SCXK （ 辽）2015-0001。

2 方法与结果

2.1 HPLC 指纹图谱建立

2.1.1 麸煨诃子制备 取诃子生品适量, 以药材∶麦麸（100 ∶40）投入锅中, 温度控制在130 ～150 ℃, 麸煨20 min, 即得。

2.1.2 供试品溶液制备 取各批次麸煨诃子（去核） 适量, 粉碎, 过60 目筛。 称取药材粉末20 g,加10 倍量乙酸乙酯浸泡0.5 h, 加热回流提取3次, 1 h/次, 过滤, 合并滤液； 药渣晾干, 以正丁醇同法处理； 另取药材粉末20 g, 以纯净水同法处理, 即得3 个部位提取液。 精密量取各提取液30 mL, 减压回收溶剂, 以70%甲醇复溶, 定容于25 mL 量瓶, 摇匀, 精密量取溶液1 mL 置于10 mL量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 用0.45 μm 微孔滤膜过滤, 滤液为供试品溶液。 剩余各部分减压回收溶剂, 冷冻干燥得各部位提取物, 以备药效实验用。

2.1.3 对照品溶液制备 精密称取对照品没食子酸、 鞣花酸适量, 加甲醇配制成0.022 4 mg/mL 没食子酸、 0.035 1 mg/mL 鞣花酸的混合对照品溶液。

2.1.4 色谱条件 安捷伦C18柱 （250 nm ×4.6 mm, 5 μm）； 流 动 相 甲 醇 （A） -磷 酸 水（B）, 梯度洗脱（0～8 min, 95.0% ～90.0%B； 8 ～15 min, 90.0% ～75.0%B； 15 ～25 min, 75.0% B；25 ～30 min, 75.0% ～70.0% B； 30 ～50 min,70.0% ～55.0%B； 50 ～55 min, 55.0%B）； 体积流量1.0 mL/min； 检测波长270 nm； 柱温30 ℃； 进样量10 μL[5]。

2.1.5 指纹图谱 按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1.4” 项色谱条件下进样, 利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A 版）进行共有峰的匹配。 3 个部位的指纹图谱来源于10批麸煨诃子样品, 分别与其生成的对照图谱比较,水提部位、 正丁醇部位、 乙酸乙酯部位相似度分别在0.924 ～0.992、 0.925 ～0.990、 0.912 ～0.984 之间, 分别有32、 22、 18 个共有峰, 见图1。

2.2 药效实验

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.1 供试药液制备 将“2.1.2” 项下各部位提取物, 用0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 溶液配成质量浓度为0.14 g/mL 的药液（以生药量计算）, 再将各批次的药液合并混匀, 即得3 个部位供试药液（混合药液分别对应3 个部位指纹图谱）； 称取阳性药柳氮磺胺吡啶片剂适量, 研细,加0.5%CMC-Na 溶液配成0.05 g/mL 药液, 4 ℃保存备用。

2.2.2 动物造模和给药 小鼠于实验室适应性喂养7 d 后, 随机分为空白组、 模型组、 阳性药组、水提部位组、 正丁醇部位组、 乙酸乙酯部位组, 每组8 只。 参考文献[6-7], 采用乙酸灌肠法建立小鼠溃疡性结肠炎模型, 空白组小鼠以生理盐水代替乙酸同法制备。 造模24 h 后, 按体质量0.1 mL/10 g灌胃给药, 各给药组给予对应提取部位的药液, 阳性药组以柳氮磺胺吡啶药液灌胃, 空白组和模型组以0.5% CMC-Na 溶液灌胃, 1 次/d, 连续7 d, 于第8 d 眼球取血后处死, 解剖取结肠, 测量长度并称定质量。 取2 cm 结肠组织, 剪碎, 加磷酸盐缓冲溶液（PBS） 制成10% 的组织匀浆[8]。 将眼球血和组织匀浆液置于离心管中, 3 000 r/min离心20 min, 吸取上清保存备用。

2.2.3 指标测定与数据处理 采用ELISA 法对样本进行指标测定。 取血清样本, 按MDA、 SOD 试剂盒说明书操作； 取结肠组织样本, 按IL-1β、TNF-α、 IL-10 试剂盒说明书操作。 采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。

2.2.4 对药效指标的影响 表2 ～3 显示, 与空白组相比, 模型组小鼠血清MDA 显著升高, SOD 活性显著降低, 结肠组织IL-1β、 TNF-α 含有量显著升高, 而IL-10 含有量显著降低（P＜0.01）。 与模型组相比, 各给药组的血清和结肠组织MDA、 IL-1β、 TNF-α 含有量均显著降低, SOD 活性、 IL-10含有量均显著升高（P＜0.01）。 不同部位组间比较, 仅与水提部位组比较, 正丁醇部位组SOD 活性增强存在显著性差异（P＜0.05）。

表2 麸煨诃子不同部位对血清中MDA、 SOD 的影响 ±s， n=8）Tab.2 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of serumal MDA， SOD ±s， n=8）

表2 麸煨诃子不同部位对血清中MDA、 SOD 的影响 ±s， n=8）Tab.2 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of serumal MDA， SOD ±s， n=8）

注：与空白组比较,＃＃P＜0.01；与模型组比较,**P＜0.01；与水提组比较,ΔP＜0.05

images/BZ_162_236_1153_1194_1203.png空白组 4.83±0.51 86.68±1.50模型组 33.79±1.28＃＃ 24.77±1.98＃＃阳性药组 7.41±0.50** 59.62±4.68**水提部位组 10.07±1.23** 60.87±3.47**正丁醇部位组 9.64±1.22** 69.77±4.37**Δ乙酸乙酯部位组 10.45±1.61** 66.78±4.46**

表3 麸煨诃子不同部位对肠组织中IL-1β、 TNF-α、 IL-10的影响s， n=8）Tab.3 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of intestinal tissues of IL-1β， TNF-α， IL-10 ， n=8）

表3 麸煨诃子不同部位对肠组织中IL-1β、 TNF-α、 IL-10的影响s， n=8）Tab.3 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of intestinal tissues of IL-1β， TNF-α， IL-10 ， n=8）

注：与空白组比较,＃＃P＜0.01；与模型组比较,**P＜0.01

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2.3 不同部位指纹图谱与药效关系 参照灰色关联分析法, 本实验中以药效指标数值为参考序列,以指纹图谱共有峰面积数据为比较序列[9], 首先对共有峰峰面积进行无量纲化处理[10], 再通过灰色关联软件（V 3.0） 将指纹图谱共有峰数据分别与5 组药效数值进行关联分析, 最终以5 组关联度的均值表示二者关联结果。

结果见表4, 灰色关联分析得出, 麸煨诃子抗小鼠溃疡性结肠炎作用贡献度较大的峰（编号）顺序为21＞9＞25＞30＞14＞31＞28＞3＞32＞13＞26＞15＞8 号, 关联度均在0.70 以上, 表明其所代表的化学成分抗小鼠溃疡性结肠炎作用的关联度较大, 其中32 号峰为鞣花酸, 3 号峰为没食子酸。

表4 麸煨诃子不同部位共有峰数据与其药效相关性Tab.4 Correlation between the common peak data of different parts of T. chebula roasted with wheat bran and efficacy

3 讨论

溃疡性结肠炎的临床症状主要表现为泄泻、 腹痛、 便中带血[11], 本实验采用乙酸灌肠法复制小鼠溃疡性结肠炎模型, 造成小鼠稀血样便、 肛门污秽、 体质量下降、 皮毛无光泽等状况, 与溃疡性结肠炎的临床症状相符； 与空白组相比, 模型小鼠血清MDA 含有量升高, SOD 活性降低, 结肠组织中促炎因子IL-1β、 TNF-α 水平升高, 抑炎因子IL-10水平下降。 MDA 是机体自由基参与过氧脂化反应的产物, 具有细胞毒性, 损害机体[12]； SOD 是1种活性酶, 可以清除自由基, 活性降低, 清除作用减小, 导致自由基反应增加[13-14]； 同时, 结肠中促炎因子和抑炎因子的失衡导致肠道内环境紊乱,从而加重炎症[15]。 经过给药治疗后, 各给药组小鼠状态与模型组相比得到明显改善, 各项指标与模型组具有显著性差异, 表明麸煨诃子3 个部位提取物通过减少模型小鼠体内自由基的表达, 下调IL-1β、 TNF-α, 促进IL-10 产生, 达到改善小鼠溃疡性结肠炎的作用； 比较组间不同部位的各项指标,除正丁醇组SOD 活性较水提部位组增强具有显著性差异外, 其余指标无显著性差异, 无法比较出药效最好的部位, 但是正丁醇部位治疗小鼠溃疡性结肠炎作用的趋势较明显。

本研究药效实验存在5 组指标数值, 每组药效数值与共有峰数据计算关联度, 得到5 组关联度结果。 比较发现不同指标对同一个特征峰会表现出不同的关联度, 这表明不同指标受到某一成分的调控作用是不同的, 无从判断哪一组药效数值对应的关联度结果更接近正确值[16]。 因此, 本实验以5 组关联度的均值[17]作为综合关联度, 来判断共有峰对药效的贡献度。 可以更好地反映特征峰与抗小鼠溃疡性结肠炎作用的关系, 提高可信度, 故认为综合关联度较大的21、 9、 25、 30、 14、 31、 28、 3、32、 13、 26、 15、 8 号峰代表的化学成分是麸煨诃子抗小鼠溃疡性结肠炎作用的基本药效成分, 将3个部位中的上述峰的峰面积加和, 正丁醇部位的峰面积总和最大, 表明这些峰所代表的化学成分在正丁醇部位中含有量最多, 符合药效实验得到的结果, 即正丁醇部分表现出更好的治疗趋势。 但对于上述共有峰, 目前只确定了32 号鞣花酸和3 号没食子酸, 其他化学成分的确定有待后期研究。

本课题前期实验[18]发现31 号峰在麸煨后峰面积减小, 而与其相连的32 号峰峰面积增加, 二者对抗小鼠溃疡性结肠炎作用的贡献度都较大, 推测二者在诃子麸煨过程中发生转化, 对此验证仍需进一步研究。

本实验通过麸煨诃子不同部位谱效关系研究,初步明确了麸煨诃子固肠止泻作用的药效物质, 以期为进一步探讨诃子煨后固肠止泻的炮制原理提供参考。