赤芍饮片加工工艺的优化

付士朋， 沈宏伟， 王谦博， 张 爽， 刘 悦， 王 聪， 李俊萍， 王振月*

（1. 黑龙江中医药大学， 黑龙江 哈尔滨150040； 2. 广东药科大学附属第一医院， 广东 广州510000）

赤芍为毛茛科芍药Paeonia lactiflora Pall. 或川赤芍Paeonia vitchii Lynch. 的干燥根, 始载于《神农本草经》, 列为中品, 具有活血化瘀、 清热凉血的功效[1]。 赤芍为大宗常用药, 其主要生理活性成分包括酚酸类、 单帖苷类及苯肽类[2-3]。 现代研究表明赤芍具有调节免疫、 抗炎、 解痉挛以及抗惊厥的作用, 且可改善心肺功能、 抑制癌细胞增殖[4-5]。

饮片是中药依据不同需求炮制处理而形成的供配方用的中药, 是中医药的精华所在, 其质量优劣对临床疗效有严重的影响。 近年来, 赤芍饮片原料药材来源混乱及饮片生产不规范是其质量不均一的主要原因。 目前研究主要集中在赤芍总苷类、 黄酮类等有效成分的药理作用及提取工艺优化[6-9], 而关于炮制工艺研究较少, 张建英等[10]以芍药苷为评价指标考察了润透切与浸泡切和晒干与烘干的区别, 实验参考指标过于单一, 不具有全面性[11],对饮片的片型、 干燥时间、 温度未进详细的讨论。2015 年版《中国药典》 中对赤芍饮片记载为除去杂质, 大小分开, 洗净, 润透, 切厚片, 干燥。 各环节未达到细致量化。 本实验同时以赤芍中没食子酸、 氧化芍药苷、 儿茶素、 芍药内酯苷、 芍药苷、苯甲酸、 苯甲酰芍药苷、 丹皮酚为评价指标, 采用CRITIC 权重分析法计算其相关权重, 单因素实验考察片型、 干燥方法, 并结合Box-Behnken 设计响应曲面法考察润制时间、 干燥温度、 干燥时间, 优化赤芍饮片加工工艺, 建立赤芍饮片炮制加工规范, 以期为个人及企业对赤芍的炮制加工提供参考。

1 材料

H1 650 台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）； BGZ-140 型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）； HY-OBS 远红外干燥箱（天津顺诺仪器科技有限公司）； B-260 恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器有限公司）； Mettler AE240 电子天平（十万分之一, 瑞士梅特勒-托利多国际贸易有限公司）； Wasters e2695 Separations Module 高效液相色谱仪（美国Wasters 公司）； Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Thermo 公司）；Phenomenex ODS-C18柱（4.0 mm×3.0 mm, 5 μm,美国Phenomenex 公司）； 乙腈（色谱纯, 北京百灵威科技有限公司, L510S136）； 娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。 对照品儿茶素（批号 P10A8F41490 ）、 没 食 子 酸 （ 批 号Y19M8C36143 ）、 氧 化 芍 药 苷 （ 批 号Z26O8S46686 ）、 芍 药 内 酯 苷 （ 批 号Y25F8H30152）、 芍药苷 （批号X12A8C33672）、苯甲酸（批号Z18S7H21155）、 苯甲酰芍药苷（批号P02D7F26004）、 丹皮酚（批号M13S8Z30031）,含有量≥98%, 均购自上海源叶生物科技有限公司。 赤芍药材采自黑龙江大兴安岭, 经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为毛茛科芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 色谱条件 Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1%磷酸水（B）, 梯度洗脱 （0 ～10 min, 5% ～15% A； 10 ～25 min,15%A； 25 ～45 min, 15% ～35% A； 45 ～55 min,35% ～50%A； 55 ～60 min, 50% ～60%A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长228 nm； 进样量10 μL。 理论塔板数按被测物峰计算不低于3 000。

对流动相的考察, 分别用甲醇-水、 甲醇-酸水、 乙腈-水、 乙腈-酸水进行梯度洗脱, 观察各组分保留时间确定洗脱条件。 结果表明乙腈-0.1%磷酸水洗脱效果最佳, 峰形对称且分离度较好, 简便, 省时。 芍药内酯苷、 芍药苷、 苯甲酸、 苯甲酰芍药苷最大吸收峰分别为231.0、 231.2、 228.8、230.0 nm, 其他成分最大吸收峰相差较大, 分别在211.1～278.6 nm 处有吸收, 所以从吸光度的角度在231 ～228 nm 之间进一步确定最佳测定吸收波长, 经对比发现儿茶素, 氧化芍药苷等在228 nm处吸光度较其他处高, 且杂质低, 干扰小。 所以选择228 nm 为最佳吸收波长。 色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品适量,加入甲醇溶解并定溶, 制成每1 mL 含没食子酸0.021 mg、 氧化芍药苷0.312 mg、 儿茶素0.221 mg、芍药内置苷0.106 mg、 芍药苷1.013 mg、 苯甲酸0.101 mg、 苯 甲 酰 芍 药 苷0.022 mg、 丹 皮 酚0.005 mg的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 精确称取赤芍饮片2 g,置于50 mL 圆底烧瓶中, 精密加入80% 甲醇20 mL, 水浴（80 ℃） 加热回流提取1 h, 放冷,称定质量, 用80% 甲醇补足减失质量, 后将提取液经4 000 r/min 离心3 min, 取上清液过0.22 μm微孔滤膜, 即得。

2.1.4 线性关系考察 分别精密量取“2.1.2”项 下 混 合 对 照 品 溶 液2.5、 5.0、 10.0、 15.0、20.0、 25.0 μL, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样。以对照品质量浓度为横坐标（X）, 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归。 结果见表1。 表明各成分在各自的范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2” 项下混合对照品溶液, 在“2.1.1” 项色谱条件下重复进样6次。 测得各成分峰面积RSD 分别为0.61%、0.36%、 0.58%、 0.86%、 0.98%、 0.72%、1.02%、 0.46%, 表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一混合对照品溶液适量,在室温下分别于0、 2、 4、 8、 12 h, 在“2.1.1”项色谱条件下进样10 μL, 测得各成分峰面积RSD分别为0.57%、 0.74%、 0.69%、 0.73%、 0.75%、0.72%、 0.44%、 0.56%, 表明供试品溶液在室温下12 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取赤芍饮片样品6 份, 每份2 g, 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样, 测得各成分峰面积RSD 分 别 为 1.11%、 1.26%、 1.31%、 1.26%、1.39%、 1.34%、 1.22%、 1.52%, 表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知含有量的赤芍饮片6 份, 各1 g, 分别按已知含有量的50%、100%、 150% 加入对照品, 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1.1” 项色谱条件下进样, 每份溶液测定3 次, 计算回收率。 各成分平均加样回收率 （n = 6） 分别为100.4%、 99.6%、99.4%、 99.3%、 100.7%、 99.7%、 99.2%、99.2%, RSD 分 别 为 0.96%、 0.89%、 1.16%、0.91%、 1.01%、 0.95%、 1.32%、 0.86%。

2.2 权重指标确立 CRITIC 法[12]是1 种客观的权重赋值法, 分别以同一评价指标比强度和不同评价指标之间的冲突性作为基础综合衡量的计算方法。 首先对每列指标性成分进行无量纲化处理, 标准化数据= （试验值-最小值） / （最大值-最小值） ×100, 用SPSS 软件对数据进行相关性分析,得到相关系数矩阵（A）, 两两成分比较呈正相关,后由Cj得到Wj权重系数。 加权得分公式为Y=W1×没食子酸标准化数据+ W2×氧化芍药苷标准化数据+ W3×儿茶素标准化数据+ W4×芍药内酯苷标准化数据+ W5×芍药苷标准化数据+ W6×苯甲酸标准化数据+ W7×苯甲酰芍药苷标准化数据+ W8×丹皮酚标准化数据

Cj表示第j 个指标所包含的信息量, rij表示指标i 和j 之间的相关系数, Wj表示第j 个指标的客观权重, j 为标准化后列向量的标准差。

2.3 单因素试验

2.3.1 片型 取赤芍大小分档, 按相同方法软化后, 分别切制成薄片, 厚片, 斜薄片, 在烘干箱中60 ℃干燥, 按测定方法对各指标进行测定, 其中没食子酸、 氧化芍药苷、 儿茶素、 芍药内酯苷、 芍药苷、 苯甲酸、 苯甲酰芍药苷、 丹皮酚客观权重分别 为 0.099、 0.183、 0.176、 0.143、 0.102、0.093、 0.100、 0.104, 结果见表2。 综合指标平均 值 分 别 为 67.407、 49.026、 52.104。 使 用SPSS19.0 软件对不同片型进行分析, 结果显示薄片、 厚片、 与斜片有显著性差异（P≤0.01）。 实验中发现薄片的赤芍饮片容易出现翘片、 裂片的情况, 不利于运输包装运输, 所以选择相对较好的斜片为赤芍饮片最佳切制方法。

2.3.2 干燥工艺 取赤芍, 润制6 h 后取出切成斜片, 分别用远红外无风干燥、 远红外有风干燥、电热鼓风干燥箱干燥, 干燥时间6 h, 按各指标测定方法进行测定, 其中没食子酸、 氧化芍药苷、 儿茶素、 芍药内酯苷、 芍药苷、 苯甲酸、 苯甲酰芍药苷, 丹 皮 酚 客 观 权 重 分 别 为 0.105、 0.167、0.164、 0.149、 0.101、 0.084、 0.094、 0.094, 结果见表3。 不同干燥方法的综合指标平均值分别为6.051、 42.002、 91.168, 用SPSS19.0 软件对不同片型进行分析, 结果显示远红外无风干燥、 远红外有风干燥、 电热鼓风干燥箱干燥有显著性差异（P≤0.01）, 所以选择综合指标平均值较高的电热鼓风干燥箱干燥为最佳干燥方法。

表2 不同片型考察Tab.2 Inspection of different types

表3 不同干燥方法考察Tab.3 Investigation of different drying methods

2.4 Box-Behnken 响应面法

2.4.1 试验设计及结果 在单因素试验基础上,选取润制时间（A）、 干燥温度（B）、 干燥时间（C） 作为自变量, 用Design-Expert 8.0 中的Box-Behnken 响应面试验设计方法, 以没食子酸、 氧化芍药苷、 儿茶素、 芍药内酯苷、 芍药苷、 苯甲酸、苯甲酰芍药苷、 丹皮酚加权得分为因变量设计试验, 其 客 观 权 重 分 别 为0.100、 0.103、 0.097、0.109、 0.104、 0.175、 0.183、 0.128。 结 果 见表4。

2.4.2 数据处理与分析 对数据进行拟合分析,得到浸润时间、 干燥温度、 干燥时间与综合评价指标的二次多元回归模型方程综合评价指标Y =90.71+15.53 A+9.47 B+7.70 C+6.90 AB+0.20 AC+21.05 BC-33.87 A2-28.80 B2-20.71 C2, 相关系数r=0.990, 校正系数0.981, 表明该试验模型拟合度良好, 误差小, 可应用于赤芍饮片工艺优化的理论预测, 对该模型进行方差分析, 见表5。

由方差分析可知, 综合评分响应值P ＜0.000 1, 表明二次回归方程模型差异极显著, 而失拟项为0.111 4, 差异不显著, 表明未知因素干扰性小。 回归方程较好的反映出润制时间、 干燥温度、 干燥时间与综合评分之间的关系, 各因素评分的影响顺序为润制时间＞干燥温度＞干燥时间。 为了进一步研究相关变量之间的交互作用, 利用响应曲面曲线图和等高线图来进行可视化分析确定最佳工艺。 响应曲面曲线图可以直观的反映出两变量交互作用的程度, 等高线越趋向椭圆, 表明交互作用越强； 越趋向圆, 表明交互作用越弱[13], 结果见图2。 Design-Expert 8.0 软件得出赤芍饮片工艺最佳为润制10.10 h, 干燥温度66.45 ℃, 干燥时间6.7 h。 加权得分95.29。

表4 试验设计与结果Tab.4 Design and results of tests

图2 各因素响应面图（加工工艺）Fig.2 Response surface plots for various factors （processing technology）

2.4.3 验证试验 根据拟合的最优条件, 考虑实际操作, 将炮制工艺调整为浸润时间10 h, 干燥温度66 ℃, 干燥时间6.5 h, 重复3 次, 结果见表6。 表明该工艺合理, 可行稳定性与重复性好, 可用于赤芍饮片加工工艺。

3 讨论

赤芍常作为清热药经配伍入药, 用量极大, 以北京中医药大学使用量为例, 在2013 至2016 年平均处方用年量4 t[14]。 现今赤芍饮片存在问题较多, 首先是其切制薄厚不规范, 有些出售的饮片厚度达0.5 cm, 完全不利于饮片在煎煮时有效成分的溶出； 其次是饮片中碎片, 裂片明显, 饮片不仅对厚度有要求, 还应注重外观形态。 造成这些问题的原因是部分药商为节约成本, 购买统货自行切制, 缺乏相应的赤芍饮片标准。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

表6 验证试验结果Tab.6 Results of verification tests

赤芍有效成分较多, 成分复杂。 因此研究赤芍多种成分需要确定权重系数, 权重系数是中药多成分评价指标, 权重系数法能客观利用数据信息指导各评价的权重系数, 是基于数据本身相关系数及标准偏差来确定权重的客观评价方法[15], 现在的工艺炮制多用该法计算权重系数, 黄潇等[16]在栀子炭微波炮制优化工艺, 陈达等[17]在盐炙工艺优化中均采用此评价方法与Box-Behaken 响应面法结合, 优化了多指标评价且预测性良好。 本实验结合赤芍各指标成分的相关性确定权重顺序为苯甲酸芍药苷＞苯甲酸＞丹皮酚＞芍药内酯苷＞芍药苷＞氧化芍药苷＞没食子酸＞儿茶素。

前期实验采用全因子实验对赤芍饮片加工过程中可能影响赤芍饮片质量的因素进行分析, 通过实验操作选出7 个影响加工因素（浸泡时间、 润制时间、 润制时水温、 片型、 干燥方法、 干燥温度、干燥时间）, 结果显示润制时间、 片型、 干燥方法、 干燥温度、 干燥时间为主要影响因素。 片型与干燥方法2 种因素不呈梯度变化, 所以对其采用单因素试验方法, 而润制时间、 干燥时间、 干燥温度呈梯度变化, 所以采用响应曲面法, 结合2 种方法可对赤芍炮制工艺进行全面而系统的研究。 最终得出浸润时间10 h, 切斜片, 鼓风干燥, 干燥温度66 ℃, 干燥时间6.5 h 为最佳工艺。 该工艺简单可行, 质量稳定, 可为赤芍饮片加工工艺提供参考。