地椒质量标准的研究

常小强， 赵一帆， 马 悦， 王 坤， 孙 鹏， 张 东， 杨 岚（中国中医科学院中药研究所， 北京100700）

地椒为唇形科百里香属植物百里香Thymus mongolicus （Ronn.） Ronn. 或兴凯百里香Thymus przewalskii （Kom） Nakai 的干燥地上部分[1], 主要分布于河北、 山西、 陕西、 甘肃、 宁夏等地[2]。地椒, 始载于《嘉佑本草》, 味辛, 温, 有小毒,具有温中散寒、 驱风止痛的功效[3]。 百里香和兴凯百里香的化学成分研究主要集中在挥发油, 已报道化学成分有芝麻素、 木栓酮、 表木栓醇、 β-谷甾醇等[4]。 药理学研究表明, 地椒具有抗炎、 抗氧化、 抗肿瘤、 抑菌、 抑制血栓形成、 减轻过敏反应等作用[5-8]。 有关地椒质量标准, 在1977 年版《中国药典》、 2009 年版《甘肃省中药材标准》 和2013 年版《山西省中药材标准》 中, 仅见“来源、性状、 显微鉴别、 炮制、 性味与归经、 功能与主治、 用法与用量、 贮藏” 项目, 2013 年版《山西省中药材标准》 增加检查项下“杂质、 水分、 总灰分、 酸不溶性灰分、 浸出物”, 均未收载薄层鉴别、 含有量测定相关标准。

同 属 植 物 Thymus vulgaris、 Thymus zygis、Thymus serpyllum 收载于《欧洲药典》 （EP 8.0）和《英国药典》 （BP 2013）, 入药部位为干燥叶和花、 全草或干燥带花地上部分, 薄层鉴别药材中含有麝香草酚和香荆芥酚； 含有量测定采用气相色谱法, 测定挥发油中麝香草酚和香荆芥酚, 不得少于40%。 欧洲药典（EP 9.0） 修改薄层鉴别为以芦丁、 迷迭香酸为对照品, 检识药材中含有迷迭香酸, 而不含芦丁[9-10]。 本研究参考国外药典同属植物相关标准, 选取具有抗炎、 抗氧化、 抗肿瘤、 抑菌、 抑制血栓形成、 抗过敏作用的迷迭香酸[11-13]作为薄层鉴别和含有量测定指标性成分[14-15], 对20 批样品进行薄层鉴别和含有量测定, 并测定了药材的水分、 灰分和浸出物, 以期建立地椒定性和定量评价方法, 完善其质量标准, 为其质量控制提供依据。

1 材料

1.1 材料 迷迭香酸对照品（中国食品药品检定研究院, 批号111871-201706, 含有量90.5%）；乙腈（色谱纯, 赛默飞世尔科技有限公司）； 磷酸（色谱纯, 上海安谱实验科技股份有限公司）； 其他试剂为分析纯（北京化工厂）。 20 批地椒样品,经北京中医药大学刘春生教授鉴定为唇形科百里香属植物百里香Thymus mongolicus Ronn. 或兴凯百里香Thymus przewalskii Nakai 的干燥全草, 信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.2 仪器 LC-2010AHT 色谱仪 （日本岛津公司）； XS105 DualRange 电子天平、 AL204-lC 电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）； DK-98-1 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）； RJM-2810 茂福电阻炉（北京电炉厂）； ZF-90 多功能暗箱式紫外透射仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；KQ-300E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； DHG-9 140 A 型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）； 高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别 取地椒粉末5 g 至锥形瓶中,加甲醇50 mL, 超声处理10 min, 滤过, 滤液作为供试品溶液。 另取迷迭香酸对照品, 加甲醇制成每1 mL 含64 μg 的溶液, 作为对照品溶液。 照薄层色谱法（通则0502） 试验[15], 吸取上述2 种溶液各2 μL, 分别点于同一硅胶G 薄层板上, 以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（3 ∶10 ∶0.2） 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外光灯（365 nm） 下检视,供试品色谱中, 在与对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的荧光斑点。 见图1。 结果表明不同产地地椒均含有迷迭香酸。

图1 地椒薄层色谱图Fig.1 TLC chromatogram of thyme

2.2 迷迭香酸含有量测定

2.2.1 色谱条件[16]Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）； 流动相乙腈-0.1% 磷酸溶液（17 ∶83）； 检测波长330 nm； 柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min； 进样量10 μL。 在上述色谱条件下, 迷迭香酸峰与相邻色谱峰分离度大于1.5, 且样品中无其他成分干扰, 理论板数按迷迭香酸峰计算不低于6 000。 见图2。

2.2.2 对照品溶液制备 取迷迭香酸对照品适量,精密称定, 加60%丙酮制成每1 mL 含0.352 mg 的溶液, 经0.22 μm 微孔滤膜过滤, 取续滤液,即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取地椒粉末（过40 目筛） 约0.5 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入60%丙酮25 mL, 密塞, 称定质量, 加热回流30 min, 放冷, 再称定质量, 用60%丙酮补足减失质量, 摇匀, 经0.22 μm 微孔滤膜过滤, 取续滤液, 即得。

2.2.4 线性关系考察 精密量取“2.2.2” 项下对照品溶液, 加60%丙酮分别制成每1 mL 含迷迭香 酸 352、 176、 88、 44、 22、 11、 5.5、 2.75、1.375、 0.687 5、 0.343 7 μg 的溶液, 经0.22 μm微孔滤膜过滤, 取续滤液, 在“2.2.1” 项条件下进样。 以迷迭香酸对照品的进样质量为横坐标（X）、 峰面积积分值为纵坐标（Y）, 得回归方程Y=3 454.101 47 X-33 768.504 57, r=0.999 9, 表明迷迭香酸在3.44 ～3 520.45 ng 范围内线性关系良好。

图2 迷迭香酸HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of rosmarinic acid

2.2.5 精密度试验 取T-4 号样品, 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液, 在“2.2.1” 项色谱条件下, 连续重复进样6 次, 连续测3 d, 记录峰面积。 测得3 d 日内精密度RSD 分别为0.202%、0.290%、 0.072%, 日间精密度为0.294%, 表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取T-4 号样品, 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液, 在“2.2.1” 项色谱条件下, 分别于0、 3、 6、 12、 24、 36、 48 h 进样,记录峰面积。 测得迷迭香酸峰面积RSD 1.015%,表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取T-4 号样品, 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6 份, 在“2.2.1” 项色谱条件下进样, 记录峰面积并计算迷迭香酸含有量, 测得迷迭香酸的平均含有量2.92 mg/g, RSD 0.479%, 表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含有量的T-4 号地椒约0.25 g 精密称定9 份, 分别精密加入迷迭香酸对照品, 对照品加入量与所取供试品中待测成分量之比为0.5 ∶1、 1 ∶1、 1.5 ∶1, 然后按“2.2.3” 项 下 方 法 制 备 供 试 品 溶 液, 在“2.2.1” 项色谱条件下测定, 计算回收率, 结果见表2。

表2 迷迭香酸加样回收率试验结果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests for rosmarinic acid（n=9）

2.2.9 样品含有量测定 取20 批样品, 分别按“2.2.3” “2.2.2” 项下方法制备供试品溶液、 对照品溶液, 在“2.2.1” 项色谱条件下测定。 结果见表3。

表3 迷迭香酸含有量测定结果（mg/g， n=3）Tab.3 Results of content determination of rosmarinic acid（mg/g， n=3）

2.3 检查项及浸出物测定 采用2015 年版《中国药典》 （四部） 中的烘干法测定药材中水分,总灰分测定法测定总灰分、 酸不溶性灰分, 热浸法测定醇溶性浸出物[16], 每批样品平行测定2次, 结果见表4。 根据测定结果, 确定地椒水分不得过10.0%, 总灰分和酸不溶性灰分分别不得过17.0% 和 8.0%, 醇溶性浸出物不得少于6.0%。

3 讨论

本实验建立的方法简便易行, 能够准确、 科学地评价地椒质量, 相比现有质量标准, 增加了薄层鉴别和含有量测定, 补充完善检查项, 使地椒质量标准更完善全面。

表4 水分、 总灰分、 酸不溶性灰分、 醇溶性浸出物含有量测定结果（%， n=2）Tab.4 Results of content determination of water， total ash， acid-insoluble ash and alcohol-soluble extracts （%， n=2）

薄层鉴别试验, 考察不同类型薄层板, 硅胶板Si 60 （德国默克公司）、 DC-Fertigplatten SIL G-25（德国Macherey-Nagel 公司）、 硅胶板G （青岛海洋化工有限公司）, 对展开结果的影响, 结果显示该方法耐用性良好。 展开后, 直接365 nm 紫外灯下检视荧光斑点, 操作简便。

本实验参考相关文献[17-19]考察了提取溶剂（甲醇、 80% 甲醇、 稀乙醇）, 提取方法（超声提取法、 回流提取法）, 提取时间 （60、 90、 120、150 min）, 发现稀乙醇回流提取60 min 提取迷迭香酸更充分, 见表5。 在方法学考察中, 加样回收率83.00% ～100.94%, 平均值 94.94%, RSD 6.05%, 未达到药典要求。 查阅文献[20-21], 并对比迷迭香酸对照品在稀乙醇回流提取60 min 前后HPLC 检测结果, 发现迷迭香酸在含水溶剂中长时间高温加热不稳定。 后进一步考察提取溶剂（乙腈、 80%乙腈、 20%盐酸甲醇、 8%盐酸甲醇、 4%乙酸甲醇、 60%丙酮）, 最终确定最佳提取方法为60%丙酮回流提取30 min。

表5 提取方法考察结果（n=2）Tab.5 Results of extraction methods （n=2）

分析20 批不同产地样品中迷迭香酸含有量,购于安徽亳州的T-5 样品含有量较低为2.10 mg/g,其他批次含有量均高于2.10 mg/g, 故将本品迷迭香酸的含有量暂定为不得低于2.00 mg/g, 即按干燥品计算迷迭香酸的含有量不得低于0.20%。