HPLC 法同时测定新会柑种子中7 种成分

郑国栋， 杨秀娟， 巢颖欣， 胡坪君， 陈柏忠， 蔡 轶， 韦敏燕*

（1. 广州医科大学药学院， 广东 广州511436； 2. 广东新宝堂生物科技有限公司， 广东 江门529000）

陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮, 作为药食同源的材料, 主要包括广陈皮、 川陈皮、 浙陈皮、 建陈皮和赣陈皮。 其中广陈皮为茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi’ （新会柑或大红柑）的干燥成熟果皮[1], 主产于江门市新会地区, 为广东省十大道地药材之一, 也是首批立法保护的8种岭南中药材之一, 具有理气健脾、 和胃止呕、 燥湿化痰等功效[2]。

广陈皮产业发展迅速, 仅新会当地统计, 2017年广陈皮的种植规模已达7 万亩, 总产柑果超8.5万吨, 扣除果皮后果肉年产近6 万吨, 果籽近2 000吨。 尽管果肉与果籽产量极大, 但对新会柑的应用主要集中于果皮。 由于其柑肉味酸籽多, 故其果肉和果籽的处理方式通常为挖土掩埋或是直接扔入沟渠等露天场所, 不仅造成了极大的资源浪费, 也对环境造成了污染。

将柑橘果籽（种子） 作为中药橘核Citrus reticulata Semen 应用, 其具有理气、 散结、 止痛等功效[3]。 现代药理研究表明, 橘核还具有镇痛、 抗癌以及抗感染等药理活性[4]。 课题组对新会柑果皮（广陈皮） 的化学成分、 药理活性以及质量控制等已作了大量研究[5-8], 但国内外尚无新会柑果籽（种子） 的相关研究报道。 因此, 为了更好地开发利用新会柑, 本研究首次建立了HPLC 法同时测定新会柑种子中7 种成分, 以期为其资源的合理开发应用提供科学依据。

1 材料

Shimadzu LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）； UV 2300 紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）； MS205DU 分析天平（十万分之一, 瑞士梅特勒-托利多公司）； 超声波清洗机KQ-800KDE （昆山市超声仪器有限公司）。

新会柑柑果采至广东省江门市新会区, 由广州医科大学药学院蔡轶副教授鉴定为芸香科柑橘属茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi’ 的果实, 经剥离果皮, 收集种子, 洗净、 晒干得干燥成熟种子, 其样品保存于广州医科大学药学院生药学实验室。 信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

辛弗林 （批号MUST-17041915）、 没食子酸（批号MUST-17022801）、 橙皮苷 （批号 MUST-15070211）、 柠檬苦素 （批号MUST-17030220）、川陈皮素（批号MUST-15110911）、 橘皮素（批号MUST-151110912, 含有量≥98%） 均购于成都曼思特生物科技有限公司； 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黄酮（批号151123, 含有量≥98%, 四川维克奇生物科技有限公司）。 乙腈（色谱纯, 含有量≥98%美国霍尼韦尔公司）； 甲醇、 乙酸乙酯均为分析纯； 水为怡宝纯净水。

2方法与结果

2.1 HPLC 法测定7 种成分含有量

2.1.1 供试品溶液 分别称取4 批新会柑种子适量, 打粉, 粉末过3 号筛, 精密称取粉末0.2 g 于100 mL 锥形瓶中, 加入20 mL 甲醇, 超声提取（320 W、 40 kHz） 30 min, 过滤, 即得。

2.1.2 对照品溶液 精密称取一定量的7 种对照品至50 mL 量瓶中, 加甲醇溶解并定容, 使制成质量浓度分别为辛弗林37.560 μg/mL、 没食子酸1.200 μg/mL、 橙皮苷341.700 μg/mL、 柠檬苦素392.980 μg/mL、 川陈皮素71.040 μg/mL、 3, 5,6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黄酮9.960 μg/mL 和橘皮素49.320 μg/mL 的混合对照品贮备液, 冰箱4 ℃保存备用。 临用前, 加甲醇稀释至适宜浓度, 即得。2.1.3 色谱条件 DIKMA Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流动相磷酸水（A） -（甲醇∶乙腈=1 ∶1, B）, 梯度洗脱, 程序见表2；检测波长辛弗林（224 nm）, 没食子酸（218 nm）,橙皮苷（283 nm）, 柠檬苦素（209 nm）, 川陈皮素、 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黄酮、 橘皮素（330 nm）； 柱温30 ℃； 体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。 色谱图见图1。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 波长选择 分别精密称取一定量7 种对照品于量瓶中, 加入甲醇溶解并定容, 备用。 以甲醇为空白对照溶液, 在190～900 nm 波长范围内进行扫描, 以对照品溶液和供试品溶液均有较大吸收为指标选择测定波长, 最终7 种成分的检测波长分别确定为辛弗林（224 nm）, 没食子酸（218 nm）,橙皮苷（283 nm）, 柠檬苦素（209 nm） 和川陈皮素、 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黄酮、 橘皮素（330 nm）。

2.1.5 线性关系考察 精密量取混合对照品贮备液, 加入甲醇稀释, 配制成6 个质量浓度水平。 在“2.1.3” 项色谱条件下进样分析, 每个样品重复测3 次。 分别以对照品质量浓度为横坐标（X）,峰面积值为纵坐标（Y） 进行回归, 结果见表3。检测限（LOD） 和定量限（LOQ） 分别是当信噪比（S/N） 为3 和10 时化合物的质量浓度。

2.1.6 精密度试验 分别选取低、 中、 高3 个质量浓度的混合对照品溶液, 在“2.1.3” 项色谱条件下重复进样3 次, 测得7 种成分RSD 分别为1.0%、 1.7%、 1.7%、 0.4%、 1.2%、 0.5% 和1.1%, 表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 选择第S1 批样品, 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1.3”项色谱条件下, 于0、 2、 4、 8、 12、 24、 48 h 进样, 测得7 种成分RSD 分别为0.7%、 1.3%、0.5%、 2.3%、 1.4%、 0.3% 和0.2%, 表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 精密称取第S1 批的新会柑种子粉末, 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1.3” 项色谱条件下进样, 测得7 种成分的含 有 量 分 别 为0.041、 0.004、 0.423、 20.480、0.405、 0.069、 0.303 mg/g； RSD 分别为1.2%、2.2%、 0.5%、 2.5%、 1.9%、 0.5% 和0.2%, 表明该方法重复性良好。

表3 各成分线性关系（n=3）Tab.3 Linear relationships of various constituents （n=3）

2.1.9 加样回收率试验 精密称取已知含有量的第S1 批新会柑种子粉末6 份, 每份0.2 g, 分别加入一定量的混合对照品, 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1.3” 项色谱条件下进样,测定7 种成分含有量, 计算加样回收率。 7 种成分平 均 回 收 率 分 别 为 98.546%、 101.703%、100.298%、 98.719%、 101.769%、 100.516%、100.032%； RSD 分 别 为 2.1%、 2.6%、 1.5%、1.5%、 1.5%、 1.3%、 2.0%。

2.1.10 样品含有量测定 分别精密称取4 批新会柑种子粉末各0.2 g, 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液, 分别取适量经0.22 μm 针头滤膜过滤, 在“2.1.3” 项色谱条件下进样, 测定结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents （n=3）

2.2 UV 法测定总黄酮、 多甲氧基黄酮及总酚酸

2.2.1 总黄酮[9]分别称取4 批新会柑种子适量,打粉, 粉末过3 号筛, 精密称取粉末0.2 g, 加入20 mL 甲醇超声（320 W、 40 kHz） 提取30 min,提取1 次, 以橙皮苷为对照, 在283 nm 波长处测定, 采用外标一点法计算得总黄酮含有量, 结果见表4。

2.2.2 多甲氧基黄酮[10]分别称取4 批新会柑种子适量, 打粉, 粉末过3 号筛, 精密称取粉末0.2 g, 加入20 mL 乙酸乙酯超声（320 W、 40 kHz）提取30 min, 提取2 次, 合并2 次提取液, 以川陈皮素为对照, 在330 nm 波长处测定, 采用外标一点法计算得多甲氧基黄酮含有量, 结果见表4。

2.2.3 总酚酸[11]分别称取4 批新会柑种子适量, 打粉, 粉末过3 号筛, 精密称取粉末0.2 g,加入20 mL 甲醇超声 （320 W、 40 kHz） 提取30 min, 提取1 次, 以没食子酸为对照, 在765 nm波长处测定, 采用外标一点法计算得总酚酸含有量, 结果见表4。

3 讨论

在测定柠檬苦素的含有量时, 王巍静、 罗静等[12-13]采用石油醚等对其进行脱脂处理。 考虑到脱脂处理会对低极性待测成分的含有量测定带来干扰, 因此, 课题组采用超声提取法, 直接用甲醇提取, 还比较了脱脂与否对柠檬苦素含有量测定的影响, 发现两者并无显著性差异。 因此, 本实验选用甲醇超声提取。

已有研究[14]表明新会柑果皮（新会陈皮） 中以黄酮类成分为主, 其中以橙皮苷含有量最高。 本实验研究结果表明, 新会柑种子则以柠檬苦素类成分为主, 其具有抗菌、 抗炎、 镇痛、 抗癌、 降压等多种药理活性[15-17], 因此, 可考虑从中提取柠檬苦素类成分, 对新会柑种子予以开发利用。

本实验结果表明, 除柠檬苦素外, 新会柑种子还含有部分辛弗林等生物碱类、 没食子酸等酚酸类以及黄酮类成分。 辛弗林具有舒张气管平滑肌、 肝保护及改善新陈代谢等作用[18-20]； 没食子酸具有降脂、 抗菌等作用[21-22]； 黄酮类具有改善糖脂代谢、 抗氧化、 心肌保护等作用[23-24]。 本研究结果进一步表明新会柑种子具有良好的药理活性, 是1种有效的药用资源。

致谢：衷心感谢新会区人民政府、 新会陈皮行业协会等单位在样品采集及基地建设方面对本研究工作的大力支持和帮助。