低强度超声对大鼠多烯紫杉醇化疗所致骨髓抑制的影响及其机制

汪 威，刘宝茹，陈俊林，罗 东，王 嫣

(重庆医科大学生物医学工程学院 省部共建国家重点实验室培育基地—重庆市超声医学工程重点实验室 重庆市生物医学工程学重点实验室 重庆微无创医学协同创新中心，重庆 400016)

化疗是治疗恶性肿瘤的常用方法，但同时会引发诸多不良反应。化疗所致白细胞减少症、尤其是中性粒细胞减少症是常见的剂量限制性毒性反应[1-2]。目前临床广泛应用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor， G-CSF)应对化疗引起的中性粒细胞减少[3]，可引发骨痛、疲劳和发热等[4]。低强度超声用于治疗细胞周期特异性药物阿糖胞苷(作用于S期)及细胞周期非特异性药物环磷酰胺导致的白细胞减少症效果显著，可使外周血白细胞数量增加，恢复骨髓造血功能[5-7]，且辐照局部皮肤和肌肉组织无明显损伤[8-9]。本研究采用细胞周期特异性药物多烯紫杉醇建立大鼠白细胞减少症模型，观察低强度超声可否减轻化疗所致骨髓抑制，恢复骨髓造血功能，并分析其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级别雌性SD大鼠[重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(渝)2017-0023]40只，体质量120～150 g，于25℃～28℃、相对湿度40%～55%环境下饲养1周，12 h昼夜交替，自由饮食、饮水。随机均分为超声组及对照组，每组20只。

1.2 化疗方法 腹腔注射多烯紫杉醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，剂量25 mg/kg体质量，持续4天。

1.3 低强度超声治疗 采用海扶动物实验专用低强度超声治疗仪，于第1次多烯紫杉醇注射后当日开始。将探头置于大鼠右侧股骨干骺端，对超声组每日辐照1次(每次20 min)，持续7日，参数：声强200 mW/cm2，频率0.3 MHz，重复频率1 kHz，占空比20%；对照组同期予以假照(探头无能量输出)。

1.4 血常规检查 于多烯紫杉醇注射前、超声辐照开始后第4、7及14天，经大鼠眼眶取血1 ml，采用Sysmex XT-2000i全自动血细胞计数分析仪行血常规检查，记录白细胞、中性粒细胞及淋巴细胞计数。

1.5 免疫球蛋白检测 于多烯紫杉醇注射前、超声辐照开始后第4、7及14天，分别经大鼠眼眶取血2 ml，以 3 000 r/min离心10 min，取上清，采用ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测免疫球蛋白A(immunoglobulin A， IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G， IgG)及免疫球蛋白M(immunoglobulin M， IgM)表达水平。

1.6 干细胞因子(stem cell factor， SCF)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)及血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)检测 于超声辐照开始后第4天，2组各随机选取4只大鼠处死，在无菌环境下完整剥离大鼠右侧整段股骨，用PBS缓冲液反复冲洗大鼠股骨骨髓，将冲洗后的液体以3 000 r/min离心10 min，收集沉淀，采用RT-qPCR法进行检测，每个样本重复测量3次，以2-△△Ct法计算ICAM-1、VCAM-1基因信使核糖核酸(mRNA)相对表达水平，引物的正、反向核苷酸序列见表1。

1.7 组织学观察 于多烯紫杉醇注射前、超声辐照开始后第4、7及14天，对2组分别随机选取3只大鼠处死，将其右侧股骨用于组织学观察。于超声辐照开始后第7天对2组处死后的大鼠超声辐照处皮肤和肌肉组织取材。将离体标本均置于4%多聚甲醛中固定，乙醇脱水，石蜡包埋、切片，HE染色后，采用Olympus XI-70光学显微镜进行观察。采用Image J计数软件计数大鼠骨髓组织中的有核细胞，每个样本重复计数3次。

1.8 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。符合正态分布的计量资料以±s表示。2组间比较采用两独立样本t检验，组内不同时间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

开始注射多烯紫杉醇后，大鼠均出现不同程度食物和水摄入量减少、活动减少，身体蜷缩。超声组分别于注射第1、3天各死亡2只，对照组分别于注射第2、3天各死亡2只。

2.1 血常规 2组大鼠不同时间外周血白细胞、中性粒细胞及淋巴细胞检测结果见表2。

2.2 免疫球蛋白 2组大鼠不同时间免疫球蛋白检测结果见表3。

2.3 SCF、ICAM-1及VCAM-1 超声辐照开始后第4天，超声组骨髓SCF及ICAM-1 mRNA相对表达水平分别为2.34±0.11及1.86±0.10，对照组分别为1.00±0.07及1.00±0.12，超声组SCF(t=17.272，P<0.001)及ICAM-1(t=9.550，P=0.001)表达水平均明显高于对照组；超声组VCAM-1 mRNA相对表达水平为0.37±0.02，与对照组相比明显降低(1.00±0.09；t=11.940，P<0.001)。

表1 RT-qPCR检测引物的正、反向核苷酸序列

表2 2组不同时间点血常规检查结果(×109/L，±s)

表2 2组不同时间点血常规检查结果(×109/L，±s)

组别白细胞多烯紫杉醇注射前超声辐照开始后第4天超声辐照开始后第7天超声辐照开始后第14天F值P值超声组5.06±1.3711.17±2.8111.79±3.9313.88±3.958.5130.003对照组6.59±1.493.25±2.518.48±1.8913.65±2.3818.550<0.001t值1.8513.9361.4490.103——P值0.0940.0110.1940.921——组别中性粒细胞多烯紫杉醇注射前超声辐照开始后第4天超声辐照开始后第7天超声辐照开始后第14天F值P值超声组0.58±0.352.3±0.813.49±0.864.37±1.1214.990<0.001对照组1.00±0.200.20±0.022.21±0.474.69±0.28101.200<0.001t值2.0773.4702.5600.475——P值0.0830.0400.0510.660——组别淋巴细胞多烯紫杉醇注射前超声辐照开始后第4天超声辐照开始后第7天超声辐照开始后第14天F值P值超声组3.09±0.684.98±1.417.09±0.826.73±0.5314.560<0.001对照组3.17±0.950.70±0.195.49±1.135.42±1.1212.8000.001t值0.1414.0402.0601.784——P值0.8930.0270.0940.149——

注：2组多烯紫杉醇注射前、超声辐照第4、7及14天样本量均为20、16、9及6只

2.4 骨髓组织表现 超声辐照开始后第4天，2组骨髓组织有核细胞较多烯紫杉醇注射前明显减少，脂肪成分较多，但在第7、14天有核细胞逐渐增多，脂肪成分逐渐减少，见图1。

与对照组比较，超声辐照开始后第4(t=10.416，P<0.001)、7天(t=4.285，P=0.005)超声组大鼠骨髓有核细胞均明显增多，见表4。

2.5 皮肤和肌肉组织表现 超声辐照开始后第7天，2组大鼠辐照处表皮及真皮均未见明显异常，见图2；肌肉组织未见明显炎性细胞浸润，见图3。

3 讨论

本研究应用多烯紫杉醇建立大鼠白细胞减少症模型，以低强度超声治疗化疗所致骨髓抑制，发现超声辐照开始后第4天2组外周血白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞计数差异均有统计学意义(P均<0.05)，且组内不同时间点差异亦有统计学意义(P均<0.05)。相对于多烯紫杉醇注射前，对照组上述指标于超声假照第4天呈明显下降趋势,而在第7、14天表现出持续升高趋势，考虑为机体对化疗药物所致骨髓抑制的自身恢复过程；而超声组外周血白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞计数在超声辐照开始后第4天即增高，且在第7、14天保持升高趋势，分析原因，可能在于本研究以化疗与超声辐照同时进行的方法缩短了化疗后白细胞减少症的持续时间，超声辐照通过增加外周血中白细胞的数量而增强了化疗后大鼠的免疫力和抗感染能力。低强度超声主要影响外周血中白细胞的数量，而对红细胞和血小板的影响较小，可能由于白细胞的细胞周期短，化疗后白细胞下降最快。

检测免疫球蛋白水平，发现超声组在辐照开始后第7、14天IgA水平较对照组显著升高(P均<0.05)，第4、14天IgG、IgM水平较对照组显著升高(P均<0.05)，提示低强度超声可有效提高化疗后大鼠血清免疫球蛋白水平，增强机体免疫力。

骨髓造血微环境由骨髓微循环、间质细胞和细胞因子组成[10]，化疗可通过损伤基质细胞引起造血功能障碍[11]。SCF是早期造血干细胞存活、增殖和分化的关键[12]。本研究超声辐照开始第4天，超声组SCF mRNA相对表达水平较对照组显著升高，表明SCF促进了骨髓造血干细胞增殖和分化，进而促进骨髓造血功能恢复。ICAM-1和VCAM-1是骨髓基质细胞表达的2种黏附分子。ICAM-1可增强造血细胞对细胞因子的敏感性并参与造血调节[13]；VCAM-1可介导干细胞动员，在骨髓细胞的定位、增殖和分化中的作用不可替代[14-15]。超声辐照开始第4天，超声组ICAM-1 mRNA相对表达水平较对照组显著升高，且VCAM-1 mRNA相对表达水平显著降低，表明低强度超声辐照通过调节ICAM-1及VCAM-1而促进了骨髓造血细胞分裂、增殖和向外周血释放，增加白细胞数量，改善骨髓抑制。

表3 2组不同时间点血清免疫球蛋白检测(±s)

表3 2组不同时间点血清免疫球蛋白检测(±s)

组别IgA(μg/ml)多烯紫杉醇注射前超声辐照开始后第4天超声辐照开始后第7天超声辐照开始后第14天F值P值超声组2.25±0.591.96±0.201.02±0.052.38±0.3112.6700.002对照组2.05±0.461.86±0.450.83±0.091.15±0.167.8630.009t值0.4630.3523.1966.107——P值0.6670.7430.0330.004——组别IgG(mg/ml)多烯紫杉醇注射前超声辐照开始后第4天超声辐照开始后第7天超声辐照开始后第14天F值P值超声组16.07±4.3014.97±1.529.43±1.3719.84±1.878.4930.007对照组18.68±5.089.47±0.559.19±1.1212.92±0.208.5370.007t值0.7846.8060.2717.340——P值0.463<0.0010.795<0.001——组别IgM(μg/ml)多烯紫杉醇注射前超声辐照开始后第4天超声辐照开始后第7天超声辐照开始后第14天F值P值超声组999.48±203.811 107.38±182.42537.79±81.761 301.09±373.065.7110.022对照组1 075.84±319.27793.97±151.05465.83±38.86723.21±91.525.6060.023t值0.4032.6471.5903.009——P值0.7010.0380.1630.024——

注：2组多烯紫杉醇注射前、超声辐照第4、7及14天样本量均为20、16、9及6只

表4 2组不同时间点骨髓有核细胞计数(个，±s)

表4 2组不同时间点骨髓有核细胞计数(个，±s)

组别多烯紫杉醇注射前超声辐照开始后第4天超声辐照开始后第7天超声辐照开始后第14天超声组2 128±751 810±461 999±842 650±112对照组2 111±1071 230±1021 794±452 588±67t值0.25610.4164.2850.955P值0.806<0.0010.0050.377

注：每组不同时间点各随机选取3只大鼠，每只分别测量3次

图1不同时间骨髓组织病理图(HE，×200) A～D.对照组多烯紫杉醇注射前(A)、超声辐照第4天(B)、辐照第7天(C)、辐照第14天(D)； E～H.超声组多烯紫杉醇注射前(E)、超声辐照第4天(F)、辐照第7天(G)、辐照第14天(H)

此外，本研究发现低强度超声辐照不仅可通过改善骨髓造血微环境、增加骨髓有核细胞数量来恢复骨髓造血功能，且对辐照局部皮肤和肌肉无明显损伤。

综上所述，本研究应用化疗药物多烯紫杉醇建立白细胞减少症模型，以低强度超声辐照有效改善化疗所致骨髓抑制，恢复骨髓的造血功能。本研究的主要不足：①采用单药化疗，而临床治疗恶性肿瘤多采用联合化疗；②低强度超声用于治疗化疗后骨髓抑制的参数、评价指标及机制均需进一步研究。