一氧化氮合酶在外阴慢性单纯性苔藓和外阴硬化性苔藓中的表达

李单祎 武 昕

一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物体内一种生物调节性介质，具有许多生物学活性，参与机体多种生理病理过程。NO具有扩张血管，增加血管内皮通透性，与血管生长因子相互作用，促进血管生成的作用。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是作用于L—精氨酸和O2生成NO的关键酶，NOS包括三种同工酶，即神经型(nNOS)，诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS)。外阴色素减退性疾病，又称外阴上皮非瘤样病变，是一组以瘙痒为主要症状、外阴皮肤色素减退为主要体征的外阴皮肤疾病，主要包括外阴慢性单纯性苔藓(lichen simplex chronicus，LSC)和外阴硬化性苔藓(lichen sclerosus，LS)，病因及发病机制尚未阐明[1]。LSC先前的疾病名“外阴鳞状上皮增生”已不再采用。本研究目的是检测iNOS和eNOS在外阴正常皮肤、LSC和LS中的表达，并以人原始造血细胞抗原(CD34)标记微血管内皮细胞，测量各组织的微血管密度(MVD)，探讨iNOS和eNOS与LSC和LS发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本 选取中国医科大学附属第一医院病理教研室1998-2014年存档的蜡块：外阴慢性单纯性苔藓(LSC)30例，外阴硬化性苔藓(LS)30例，外阴正常皮肤10例。

1.1.2 试剂 兔抗人iNOS、eNOS多克隆抗体(工作浓度1∶100)，兔抗人CD34多克隆抗体(工作浓度1∶80)，即用型SABC试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学方法 免疫组织化学SABC法。

1.2.2 结果判定 iNOS和eNOS蛋白定位在细胞浆中，以棕黄色颗粒细胞为阳性细胞。在高倍镜下(400)任意选取5个视野，计数平均的阳性细胞数，取5个数值的平均数作为阳性细胞数。CD34蛋白主要定位于细胞浆中，呈棕黄色颗粒。阳性标准按Weidner等[2]方法检测，每张切片选择3个血管最密集的区域(新生血管热点区)，在高倍镜下(400)随机计数5个视野内的微血管数，取其平均值作为MVD值。

1.2.3 统计学方法 所有数据资料用SPSS 13.0进行处理，各组计量资料的结果采用t检验，比较iNOS和eNOS表达的一致性采用Kappa检验，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 iNOS和eNOS在LSC和LS中的表达 在外阴正常皮肤中无表达。在LSC和LS中阳性细胞表达于真皮浅层，在表皮细胞中不表达。iNOS在LSC和LS中阳性细胞多表达于淋巴细胞、少量浆细胞及血管内皮细胞。eNOS在LSC和LS中阳性细胞多表达于血管内皮细胞(图1、2，棕黄色颗粒为阳性细胞)。LSC中iNOS和eNOS的表达高于LS(P<0.05)。见表1。

2.2 CD34蛋白在外阴正常皮肤、LSC、LS中的表达及MVD值 CD34蛋白在外阴正常皮肤、LSC、LS中均呈阳性表达。CD34在血管内皮细胞中表达，在新生血管内皮中表达远大于非新生血管内皮(图3、4，棕黄色颗粒为阳性细胞)。LSC中MVD高于LS(P<0.05)，LS的MVD低于外阴正常皮肤(P<0.05)。见表2。

表1 iNOS和eNOS蛋白在LSC和LS中的表达

注：*表示P<0.05

图1 iNOS在LSC中的阳性表达(SABC，×100) 图2 eNOS在LS中的阳性表达(SABC，×100)图3 CD34在LSC中的阳性表达(SABC，×100) 图4 CD34在LS中的阳性表达(SABC，×100)

表2 外阴正常皮肤、LSC、LS中的MVD值

注：*表示P<0.05

2.3 iNOS和eNOS在LSC、LS中表达的关系 见表3。

3 讨论

由NOS合成的NO是人体内重要的信号分子，其功能复杂。生理浓度的NO(pmoL或fmoL水平)参与信息传递和细胞保护作用，而过量的NO(nmoL水平)见于病理刺激和炎症反应时。iNOS一经诱导生成，即大量合成NO介导炎症发生，诱导血管生成，可加重炎症反应过程。iNOS可间接激活eNOS，使其在病理情况下表达增加，经eNOS产生的NO起到扩张血管、增加微循环通透性的作用，保证血液供应。CD34是一种血管内皮标志物，且敏感性较强，因此用CD34可测量组织内微血管密度(MVD)，MVD是血管生成的定量指标。

表3 iNOS和eNOS在LSC、LS中表达的关系

注：Kappa=0.811,P<0.05

本研究发现，在外阴正常皮肤中，无iNOS蛋白表达；在LSC中，iNOS蛋白表达上调。LSC主要病理表现为鳞状上皮表层细胞的角化过度和角化不全，棘层细胞增生，真皮浅层纤维化并伴有不等量炎症细胞浸润[1]。目前病因不清，可能与机体免疫状况和局部炎性刺激及对其他外来刺激反应过度有关[3]。NOS在人体内广泛分布，其中血管内皮细胞是最集中部位[4]。祝青[5]研究表明IL-12、IFN-γ在外阴白色病变组织中高表达。李娟等[6]研究表明IFN-γ在外阴鳞状上皮增生组织中高表达。IL-1、IL-12、IFN-γ、TNF-α等炎性介子刺激并诱导真皮内单核巨噬细胞、中性粒细胞和血管平滑肌细胞等产生iNOS。经iNOS产生的NO对淋巴细胞、浆细胞的趋化性有促进作用，有利于炎细胞的浸润。因此，在真皮组织中有大量炎细胞浸润，可能与NO的趋化作用有一定关系。本研究发现，LSC和外阴正常皮肤的MVD值比较无显著性差异(P>0.05)，说明LSC病变并没有引起血管数目的明显增多，但iNOS表达增多，使血管扩张、渗透性增加，这一点与LSC真皮组织内炎症的形成相一致。李红钢等[7]研究显示在支气管黏膜上皮增生和鳞状化生中有iNOS的表达，并提示iNOS参与了支气管黏膜增生和鳞状化生的炎症过程。张小艳等[8]研究显示在幽门螺旋杆菌相关性胃炎中有iNOS的表达，iNOS促进炎症反应发生，加重胃黏膜损伤，促进肠上皮化生的形成，甚至异型增生。张丽霞等[9]研究显示iNOS在肛周尖锐湿疣皮损中高表达可能促进尖锐湿疣细胞增殖及真皮乳头血管形成，参与其发病。本研究在LSC表皮并无iNOS的表达，而是表达于真皮浅层，分析在LSC中iNOS与表皮增生可能相关系，iNOS参与LSC真皮内炎症过程中的血管扩张。

在外阴正常皮肤中，无eNOS蛋白表达；在LSC中，eNOS蛋白表达上调。研究认为在炎症损伤修复过程中，eNOS在乙酰胆碱作用下由内皮细胞合成释放，iNOS又可间接激活eNOS，经eNOS产生的NO参与调节血压和器官的血流分布，阻止肾素-血管紧张素的产生，通过调节血管的舒缩功能，保证血管扩张，在血液供应上很重要。因此，在LSC中，经eNOS产生的NO起到调节血流分布、扩张血管、调节血管的口径和流量、增加微循环通透性的作用，同样起到加重真皮内炎症反应，促上皮细胞再生的作用。而LSC和外阴正常皮肤的MVD值相比较无显著性差异(P>0.05)，也提示eNOS参与了SH真皮内炎症过程中的血管扩张。

在LS中，iNOS和eNOS蛋白也均有表达。LS的病理表现为表皮变薄，过度角化及黑素细胞减少，上皮脚变钝或消失；上皮下毛细血管减少，管壁变薄，胶原纤维变性，呈匀质带改变[1]。LS病因不明，目前认为是一种自身免疫性疾病，初期免疫增强，破坏真皮内微血管，造成局部组织缺氧，胶原纤维变性，加重表皮细胞的代谢障碍[3]。LS的MVD低于外阴正常皮肤，其值比较有显著性差异(P<0.05)，证实了LS真皮组织内存在微循环障碍。这与杨静等[10]CD34在外阴病变中的研究结果相一致。iNOS在LS中表达上调，提示在微循环障碍所致的缺血缺氧状态下，诱导iNOS的产生，其生成的NO可能有扩张血管的作用，从而代偿性地改善LS的血液循环状态。iNOS间接激活eNOS，生成的NO也具有扩张血管的作用，而在LS中eNOS表达上调进一步证实了这一点。

iNOS和eNOS在LSC中的表达明显高于LS，两者相比较有显著性差异(P<0.05)，LSC的MVD值也明显高于LS，两者比较也有显著性差异(P<0.05)。说明iNOS和eNOS在LSC中的扩张血管作用是增加炎症的渗出，而在LS中的扩张血管作用是增加血管口径，改善微循环。本研究还发现，在LSC和LS中，iNOS表达阳性时eNOS也较多呈阳性表达，iNOS表达阴性时eNOS大部分也为阴性，两者呈明显正相关(P<0.05)。推测iNOS和eNOS之间可能存在协同效应，共同催化产生NO，参与LSC真皮内炎症过程中的血管扩张，在LS真皮中扩张血管，代偿性地改善LS的血液循环状态。

综上所述，NOS在LSC和LS中均参与了疾病的发展过程，因此，以NOS/NO为靶点治疗，应用NOS抑制剂，可能为LSC和LS的临床治疗开辟新途径。