超临界二氧化碳萃取结合高效液相色谱-串联质谱法测定毛发中11种常见精神药物

徐代化，欧 军，陈深树，徐期林，陈垚翰，程良红

(1.广东南天司法鉴定所，广东 深圳 518003； 2.深圳黑尔格科技有限公司，广东 深圳 518109)

我国精神药物的滥用问题日益严重，致死人数不断攀升，造成严重的社会问题。目前流行的常见精神药物包括甲基苯丙胺(冰毒)、海洛因、氯胺酮(K粉)、可待因、可卡因等。生物检材中常见精神药物的检测结果通常作为公安和司法部门执法的重要依据。与血、尿等其他生物检材相比，毛发具有易获取、易保存、目标物稳定、检测时限长等优点。因此，毛发中常见精神药物的检测吸引了各国科学家的广泛关注，目前已发展出多种毛发样品的前处理和检测方法[1-4]。其中，高效液相色谱-串联质谱法的应用最为广泛[5-7]。毛发的前处理方法包括碱性或酸性溶液消解、溶剂浸泡过夜、混合溶剂超声波提取、酶水解法等。然而上述前处理方法使用大量溶剂，且提取时间较长(10 h以上)，因此亟待开发环保、高效的提取方法。

超临界二氧化碳萃取(SFE)是一种新型的分离技术，具有操作简便、环保、高效等特点。该技术利用超临界二氧化碳的高效萃取能力，极大地提高了目标物的提取效率，避免了固相萃取净化等前处理步骤[8-9]，已被广泛应用于医药、食品及玩具检测[10]等方面，但在法医毒物领域的应用相对较少[11]。 Sachs等[12]首次开发了检测毛发中毒品的超临界二氧化碳萃取结合气相色谱-质谱联用技术。Allena等[13]在26.2 MPa和70 ℃条件下，以氯仿和异丙醇(90∶10，体积比)为添加剂进行超临界二氧化碳萃取30 min，方法适用于毛发中苯丙胺类物质的检测。Cirimele等[14]在31.03 MPa和25 ℃条件下，以甲醇-三乙胺-水(2∶2∶1，体积比)为添加剂进行超临界二氧化碳萃取20 min，方法适用于毛发中阿片类物质的检测。 Brewer等[15]在29.6 MPa和145 ℃条件下,以甲醇为添加剂进行超临界二氧化碳萃取80 min(静态萃取5 min，动态萃取75 min)，方法亦适用于毛发中阿片类物质的检测。但是以上超临界二氧化碳萃取方法只适用于单一种类精神药物，且总体萃取效率低。本文通过改进毛发样本包裹材料以及萃取夹带剂体系，优化超临界二氧化碳萃取条件，并结合高效液相色谱-串联质谱，开发了一种具有普适性的毛发中11种常见精神药物的提取和检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290Ⅱ-6470 Triple Quad高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪(美国Agilent公司)，SFT-110XW超临界CO2萃取仪(美国赛普泰克有限公司)，Water Purification System超纯水机(美国Millipore公司)，TDZ5-WS离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)，Vortex kylin-bell@5旋涡混合仪(美国其林贝尔仪器制造有限公司)，KQ-250DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HGC-12D氮气浓缩仪(天津市恒奥科技发展有限公司)。

甲基苯丙胺(MAMP)、苯丙胺(AMP)、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亚甲二氧基苯丙胺(MDA)、氯胺酮(Ketamine)、去甲氯胺酮(Norketamine)、可卡因(Cocaine)、苯甲酰爱康宁(BZE)、6-单乙酰吗啡(6-MAM)、吗啡(MOP)、可待因(Codeine)标准品(质量浓度均为1.0 mg/mL)均购自美国Cerilliant标准品公司；乙腈、甲醇和正己烷为色谱纯(99.99%)，购自德国Merck公司; 乙酸铵、甲酸为质谱纯，购自百灵威试剂公司；三氟乙酸(99.9%)购自阿拉丁试剂公司；实验用水由Milli-Q纯水系统制备；钢丝网(300、800目)购于深圳方艺科技有限公司。

标准储备液(1.0 μg/mL)：准确量取质量浓度均为1.0 mg/mL的11种精神药物标准品10 μL，分别置于10 mL容量瓶中,用少量甲醇溶解后定容至刻度，即得。

标准曲线样品：将1.0 μg/mL标准储备液分别稀释10倍和100倍，得到100、10 ng/mL的标准液，精确称量(20.0±0.1) mg空白毛发各6份，加适量丙酮至完全浸没毛发后，依次添加20 μL 10 ng/mL的标准液，10、20、80 μL 100 ng/mL的标准液，以及10、20 μL 1.0 μg/mL的标准液，充分振荡摇匀后过夜至丙酮挥干，得到毛发中加标量为0.01、0.05、0.1、0.4、0.5、1 ng/mg的样品，经SFE萃取后，氮气吹干，添加100 μL甲醇稀释，得到质量浓度分别为2、10、20、80、100、200 ng/mL的标准曲线样品，采用基质匹配标准曲线定量。

毛发样品来源于深圳宝安戒毒所5名吸毒人员(编号为SZNTMF0007-0011)，经深圳市生物医学伦理审查委员会批准(深圳伦审[2018]第(001)号)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备依次用超纯水和丙酮对毛发样品进行洗涤，晾干后剪碎至0.1～0.5 mm长。萃取系统空白样品：制备钢丝网包(300～800目，1 cm×1 cm)，不添加任何样品，用于监控萃取系统是否有干扰。空白毛发样品：准确称量20 mg剪碎后的空白毛发样品，置于上述钢丝网包中待测，以11种常见精神药物均为未检出进行空白确认，用于后续标准曲线建立以及方法精密度和回收率实验。添加样品、质控样品：准确称量20 mg剪碎后的无吸毒人员毛发样品，添加一定量混合标准溶液，晾干后置于钢丝网包中，待测。实际毛发样品：准确称量20 mg剪碎后的吸毒人员毛发样品，洗涤晾干后置于钢丝网包中，待测。

1.2.2 SFE萃取步骤将包裹20 mg毛发样品的钢丝网包置于萃取釜中；控制夹带剂(5%三氟乙酸-95%甲醇)以1.5 mL/min流入萃取釜中，保持1 min后关闭；调节CO2流速至8 mL/min，将萃取釜升温至130 ℃，出口温度设为60 ℃，待温度稳定后开始增压。当压力增至31.03 MPa，开始计算静态萃取时间，4 min后打开夹带剂泵，以0.5 mL/min流速添加至萃取釜内，同时打开萃取釜出口阀门，开始计算动态萃取时间，收集5 min后完毕；浓缩后定容至100 μL上机分析。

1.2.3 色谱条件色谱柱：Poloshell 120 EC-C18(150 mm×2.0 mm×2.7 μm)；柱温：30 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：1 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～3.50 min,10%～25% B; 3.50～4.50 min，25%～95% B; 4.50～5.00 min,95% B;5.00～5.01 min，95%～10% B;5.01～6.50 min，10% B。

1.2.4 质谱条件离子源：电喷雾电离(ESI)，正离子模式；检测方式：多反应监测(MRM)；喷嘴电压：500 V；毛细管电压：4 000 V；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：11 L/min；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：11 L/min。11种常见精神药物的毛细管出口电压、碰撞能量、加速电压及保留时间见表1。

表1 11种常见精神药物的多反应监测参数及保留时间Table 1 MRM parameters and retention times for 11 common psychotropic drugs

*quantitative ion

图1 11种常见精神药物的MRM色谱图Fig.1 MRM spectra of 11 common psychotropic drugs the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本文11种常见精神药物均为含氮原子的碱性化合物，流动相中需添加甲酸酸化。以乙腈-20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液为流动相，可有效消除峰形拖尾现象,并能减少离子抑制效应，增加目标物的响应值。在“1.2.3”条件下进行梯度洗脱，可在10 min内完成11种常见精神药物的分离检测，且分离度好，峰形尖锐。11种常见精神药物的MRM色谱图见图1。

2.2 质谱条件的优化

在ESI正离子模式下，分别对11种常见精神药物的单一标准溶液进行质谱条件优化。在喷嘴电压500 V、毛细管电压4 000 V、干燥气温度300 ℃、干燥气流速11 L/min、鞘气温度350 ℃、鞘气流速11 L/min条件下，使用全扫描(SCAN)模式选取各药物的[M+1]峰作为母离子，在单离子监测(SIM)模式下进行二级质谱扫描,分别优化了毛细管出口电压、碰撞池能量、加速电压等质谱参数，最终确定各精神药物的多反应监测参数见表1。

2.3 样品前处理的优化

以最具代表性的6-单乙酰吗啡、甲基苯丙胺、可卡因、氯胺酮为目标物制备加标0.2 ng/mg的毛发样品，甲醇为夹带剂，分别考察了SFE萃取温度、压力以及静态和动态萃取时间对萃取效率的影响。结果显示，萃取效率随着萃取温度的升高而增大，温度达130 ℃时的萃取效率最高，随着温度进一步升高，萃取效率有所下降，这可能是由于毒品在高温下部分分解所致。而萃取压力对4种毒品萃取效率的影响较为平缓，随着压力的升高，萃取效率有所提升，当压力达31.03 MPa时，萃取效率最高，此后增加萃取压力，萃取效率变化不大。此外，延长静态和动态萃取时间有助于增加4种毒品的萃取效率，但静态和动态萃取时间分别超过4、5 min后萃取效率反而下降。综上，确定最佳SFE萃取温度为 130 ℃，压力为31.03 MPa，静态和动态萃取时间分别为4、5 min。

分别以乙腈、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、5%甲酸-95%甲醇、5%三氟乙酸-95%甲醇、5%五氟乙酸-95%甲醇为夹带剂，考察了其对上述加标样品中4种毒品萃取效率的影响。结果表明，以5%三氟乙酸-95%甲醇为夹带剂时4种毒品的萃取回收率最高，这可能是由于碱性的毒品分子与有机强酸形成了离子对有机盐，增加了其在水-甲醇中的溶解度，因此选择5%三氟乙酸-95%甲醇作为夹带剂。

进一步对比了SFE萃取、甲醇超声提取以及5%盐酸溶液提取3种方法对加标0.2 ng/mg的毛发样品中4种毒品的相对提取效率。结果显示，甲醇超声提取法对于4种毒品的回收率为73.1%～81.4%，萃取时间为1 h；5%盐酸溶液提取法的回收率为72.7%～80.1%，萃取时间为12 h。而SFE萃取法的回收率最高(85.2%～88.6%)，萃取时间最短(0.18 h)。

2.4 标准曲线与检出限

按照“1.1”方法制备质量浓度分别为2、10、20、80、100、200 ng/mL的标准曲线样品，每个浓度平行测定6次取平均值，分别以质量浓度(ng/mL)为横坐标，MRM响应峰面积为纵坐标进行曲线拟合。结果表明，11种目标物均在2～200 ng/mL范围内呈良好线性，相关系数(r2)均大于0.999。将添加系列质量浓度标准品的毛发样品按照本方法进行前处理后上机检测，以信噪比(S/N)接近3时的浓度为方法检出限(LOD)，以S/N接近10时的浓度为定量下限(LOQ)，得到方法LOD为0.01～0.05 ng/mg，LOQ为 0.03～0.10 ng/mg(见表2)。

表2 方法的相关系数、检出限(LOD)、定量下限(LOQ)、回收率及相对标准偏差Table 2 Correlation coefficients，limits of detection,limits of quantitation,recoveries and relative standard deviations of the method

2.5 回收率与相对标准偏差

取空白毛发样品分别进行3个浓度水平(0.05、0.20、0.40 ng/mg)的加标回收实验，按照本方法平行测定6次，计算其回收率和相对标准偏差(RSD)。由表2可知，11种目标化合物在3个加标水平下的回收率为81.6%～94.8%，RSD为0.50%～3.4%。

2.6 案例应用

取20 mg实际吸毒人员的毛发样品，按照本方法进行前处理和检测。典型样品(编号SZNTMF0007)的MRM图谱见图2，该样品检出6-单乙酰吗啡、可待因及吗啡，含量分别为6.0、12、14 ng/mg，其中6-单乙酰吗啡为海洛因的特征代谢物，与吸毒人员吸食海洛因的事实相吻合。样品SZNTMF0008检出甲基苯丙胺和苯丙胺，含量分别为51、10 ng/mg，与吸毒人员吸食冰毒的事实相吻合；样品SZNTMF0009检出氯胺酮、去甲氯胺酮和3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺，含量分别为16、7、54 ng/mg，与吸毒人员吸食K粉(氯胺酮)的事实相吻合；样品SZNTMF0010检出可卡因、苯甲酰爱康宁以及甲基苯丙胺，含量分别为35、25、38 ng/mg，与吸毒人员吸食可卡因和冰毒的事实相吻合；样品SZNTMF0011检出苯丙胺、甲基苯丙胺、氯胺酮以及去甲氯胺酮，含量分别为16、36、30、19 ng/mg，与吸毒人员吸食冰毒和K粉的事实相吻合。

分别采用本方法的SFE条件与最新发布的司法鉴定技术规范SF/Z JD0107025-2018[16]的前处理条件对SZNTMF0008样品进行处理，采用标准方法检出甲基苯丙胺和苯丙胺的含量分别为43、8.9 ng/mg。本方法的定量结果略高于标准方法，主要原因是标准方法采用甲醇冰浴超声提取30 min，提取温度低使得提取效率略有下降。

另取SZNTMF0008样品经剪碎(0.1～0.5 mm)处理，与液氮冷冻研磨处理后进行SFE提取对比，发现后者的定量结果略高，检出甲基苯丙胺和苯丙胺的含量分别为76、18 ng/mg。主要原因是毛发样品经磨碎后目标物更易被提取。综合考虑前处理效率，本研究采用简易的毛发剪碎前处理方法。

图2 典型样品的MRM图谱(SZNTMF0007)Fig.2 MRM spectra of typical sample(SZNTMF0007)

3 结 论

本文建立了一种超临界二氧化碳萃取结合高效液相色谱-串联质谱对毛发中11种常见精神药物进行定性和定量的检测方法。该方法可在7 min内实现11种待测物的良好分离，精密度、线性关系和灵敏度等指标满足人体毛发中常见精神药物的分析要求，可为公安和司法等相关部门执法提供有力的技术支持。