碱提酸沉法提取牡丹籽饼中蛋白质的研究

徐 玥，张存劳，杨 耿，刘 凯，冯锁民

(1.西安医学院 药学院，西安 710021； 2.西安中粮工程研究设计院有限公司，西安 710082)

牡丹籽油是油用牡丹籽经加工得到的植物油，已被国家批准为新资源食品，其不饱和脂肪酸含量为82.81%～93.23%，明显高于其他普通食用植物油[1-3]。陕西油用牡丹种植面积已达4万hm2，全国排名第二，且种植面积还在逐年扩大。然而作为牡丹籽油生产的副产物牡丹籽饼，目前主要作为饲料、肥料或者废弃，造成资源浪费[4]。牡丹籽饼中富含油脂、多糖、蛋白质、多酚类等多种成分[5]，针对饼中油脂[6]、多糖[7]的综合利用开发已有文献报道，研究结果为油用牡丹资源产业链延伸提供了依据。但牡丹籽饼中蛋白质研究报道较少，牡丹籽饼中蛋白质含量达26.98%[6]，可作为天然植物蛋白来源，也可作为生物活性肽的良好来源。目前蛋白质的常用提取方法有碱提酸沉法、水提法、盐析法等，其中碱提酸沉法工业化生产应用较多。因此，本研究以牡丹籽饼为原料，采用碱提酸沉法结合单因素试验和正交试验优化蛋白质提取工艺条件，以期为牡丹籽蛋白综合利用和功能性研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

牡丹籽饼，陕西产牡丹籽不脱壳经热压榨获得；石油醚(60～90℃)、磷酸、95%乙醇、氢氧化钠，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G250，天津市科密欧化学试剂有限公司；牛血清球蛋白V(纯度≥98%，批号B21882)，上海源叶生物科技有限公司；盐酸，分析纯，四川陇西化工有限公司。

1.1.2 仪器与设备

BT125型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；DZKW型电热恒温水浴锅，北京市光明医疗仪器厂；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器责任有限公司；KH7200DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；TD5M型低速大容量离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Cary60型紫外分光光度仪，Agilent Technologies UV-Vis。

1.2 试验方法

1.2.1 牡丹籽饼脱脂处理[8]

牡丹籽饼粉碎后，过60目筛，低温干燥，以石油醚为溶剂，采用索氏提取法脱脂，备用。经凯氏定氮法测定，其蛋白质含量为21.1%。

1.2.2 牡丹籽蛋白的提取

脱脂牡丹籽粉→加一定pH的碱液→恒温振荡提取→离心(3 500 r/min，10 min)→上清液(蛋白提取液)调pH→离心→沉淀水洗至中性→牡丹籽蛋白。

1.2.3 牡丹籽蛋白提取率的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制

采用考马斯亮蓝法。精密称取考马斯亮蓝G250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇，再加85%磷酸溶液100 mL，蒸馏水稀释定容至1 000 mL，备用。精密称取牛血清球蛋白V 0.005 50 g，加蒸馏水定容至25 mL，并稀释成系列质量浓度(22、44、66、88、110、132、152 μg/mL)的标准工作液，备用。分别取不同质量浓度的标准工作液1 mL，再分别加入5.0 mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，放置5 min，于595 nm下测定吸光度(A)。以牛血清球蛋白V质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，拟合得回归方程。

1.2.3.2 牡丹籽蛋白提取液中蛋白质含量的测定

精密移取牡丹籽蛋白提取液1 mL，加入5.0 mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，放置5 min，于595 nm下测定吸光度。代入标准曲线回归方程，得到牡丹籽蛋白提取液中蛋白质含量。

1.2.3.3 蛋白提取率的计算

蛋白提取率=蛋白提取液体积×蛋白提取液中蛋白质含量/(原料质量×原料中蛋白质含量)×100%

1.2.4 牡丹籽蛋白酸沉pH的确定

取牡丹籽蛋白提取液，在25℃下分别将其pH调至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，静置1 h后离心(3 500 r/min，10 min)，沉淀水洗至中性，真空干燥至恒重。由下式计算蛋白沉淀率，进而确定酸沉pH。

沉淀率=沉淀质量/(蛋白提取液质量×提取液中蛋白质含量)×100%

2 结果与分析

2.1 蛋白标准曲线的回归方程

按照1.2.3.1绘制标准曲线，拟合得回归方程A=6.663 9C+0.022(r=0.999 5)，牛血清球蛋白V质量浓度在22～152 μg/mL范围内线性关系良好。方法学考察表明：精密度RSD为0.80%(n=6)；6 h内显色稳定性RSD为1.65%(n=6)；重复性RSD为2.0%(n=6)；平均加标回收率为95.28%、RSD为2.82%(n=9)。说明该方法可以用作蛋白质含量的测定。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对牡丹籽蛋白提取率的影响

在提取温度40℃、提取时间60 min、碱液pH 8.0条件下，考察料液比(1∶ 4、1∶ 6、1∶ 8、1∶ 10、1∶ 12)对牡丹籽蛋白提取率的影响，结果见图1。由图1可知，牡丹籽蛋白提取率随料液比增加呈先增大后减小的趋势。

图1 料液比对牡丹籽蛋白提取率的影响

2.2.2 提取温度对牡丹籽蛋白提取率的影响

在料液比1∶ 8、提取时间60 min、碱液pH 8.0条件下，考察提取温度(45、50、55、60、65℃)对牡丹籽蛋白提取率的影响，结果见图2。

图2 提取温度对牡丹籽蛋白提取率的影响

由图2可知，牡丹籽蛋白提取率随提取温度升高呈先增大后减小的趋势。随着提取温度的升高，蛋白质溶解增加和水分子运动的加剧促进了蛋白质的溶出。当提取温度超过50℃时，提取率降低，其原因可能是温度过高破坏了蛋白质的结构，导致部分蛋白质变性[9]。

2.2.3 提取时间对牡丹籽蛋白提取率的影响

在料液比1∶ 8、提取温度55℃、碱液pH 8.0条件下，考察提取时间(40、60、80、100、120 min)对牡丹籽蛋白提取率的影响，结果见图3。由图3可知，牡丹籽蛋白提取率随提取时间延长呈先增大后减小的趋势，当提取时间达60 min时，提取率达最大值。

图3 提取时间对牡丹籽蛋白提取率的影响

2.2.4 碱液pH对牡丹籽蛋白提取率的影响

在料液比1∶ 8、提取温度55℃、提取时间60 min条件下，考察碱液pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)对牡丹籽蛋白提取率的影响，结果见图4。由图4可知，牡丹籽蛋白提取率随碱液pH增加呈先增大后减小的趋势，当pH大于8.0时提取率呈下降趋势，可能是由于强碱环境破坏了蛋白质结构[10]。

图4 碱液pH对牡丹籽蛋白提取率的影响

2.3 正交试验

根据单因素试验结果进行正交试验设计，选择料液比(A)、碱液pH(B)、提取温度(C)、提取时间(D)为考察因素，各取3个水平，利用L9(34)正交表设计正交试验。 正交试验因素水平见表1，正交试验结果见表2。

由表2可知，4个因素对牡丹籽蛋白提取率的影响顺序依次为A>D>B>C(料液比>提取时间>碱液pH>提取温度)。最优水平组合为A3B2C1D3，综合考虑2.2.3项试验结果和节能减耗，最终确定最佳提取工艺条件为A3B2C1D2，即料液比1∶ 12、碱液pH 8.5、提取温度45℃、提取时间60 min。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果

2.4 验证试验

根据正交试验得到的最佳提取工艺参数，进行3次平行验证试验，测得牡丹籽蛋白提取率依次为78.19%、78.22%、78.28%，平均值为(78.23±0.04)%。

2.5 牡丹籽蛋白酸沉pH

取最佳工艺条件下获得的牡丹籽蛋白提取液，按1.2.4操作，不同pH对应的蛋白沉淀率如图5所示。由图5可知，随着pH增大蛋白沉淀率呈先增大后减小趋势。当pH为4.0时蛋白沉淀率最大，达(90.90±0.11)%。因此，选择牡丹籽蛋白酸沉条件为pH 4.0。

图5 酸沉条件对蛋白沉淀率的影响

3 结 论

在单因素试验基础上，采用正交试验优化牡丹籽饼中蛋白质的碱提酸沉提取工艺条件。确定最佳工艺条件为：料液比1∶ 12，碱液pH 8.5，提取时间60 min，提取温度45℃。在最佳工艺条件下牡丹籽蛋白提取率为(78.23±0.04)%；牡丹籽蛋白最佳酸沉条件为pH 4.0，此时蛋白沉淀率达(90.90±0.11)%。