米曲霉固态发酵玉米胚芽粕对蛋白质理化性质及抗氧化性的影响

张 会，任 健

(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006； 2.农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

玉米胚芽粕中含粗蛋白质18%～20%，粗脂肪1%～2%，粗纤维11%～12%。玉米胚芽榨油后，除油脂含量降低外，其他营养成分基本全部保留在粕中，但国内工厂一般将玉米胚芽粕做饲料处理或弃掉，并没有发挥其潜在的经济价值[1]。

米曲霉是我国酿造酱油、酒类等食品工业的传统生产菌种，是一种好气性、易培养、产复合酶的菌株，可产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等[2]。经米曲霉发酵后，玉米胚芽粕中粗纤维、植酸等难吸收的物质被降解，与传统从玉米胚芽粕提取的玉米胚芽蛋白相比，玉米胚芽粕经发酵后再从中提取的玉米胚芽蛋白性质有明显改善。陈丽安[3]采用酶法提取的玉米胚芽蛋白在溶解性、乳化性以及乳化稳定性方面都有较大提高，且溶解性在各pH范围内都能达到80%以上，受pH影响较小。王勇等[4]采用米根霉固态发酵玉米，结果发现玉米中总酚含量、抗氧化活性在发酵后得到显著提高。发酵对拓宽玉米胚芽蛋白在如饮料、肉制品加工及Pickering乳液中的应用有积极影响。

本试验以玉米胚芽粕为原料，利用米曲霉种曲对其进行固态发酵，随后利用碱溶酸沉法从发酵后的玉米胚芽粕中提取玉米胚芽蛋白，探究发酵前后玉米胚芽蛋白的表面疏水性、巯基含量及抗氧化活性等的变化，以期为玉米胚芽蛋白在食品工业中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

玉米胚芽粕，黑龙江龙凤玉米开发有限公司；米曲霉种曲，齐齐哈尔大学食品与生物工程学院提供；十二烷基磺酸钠，上海生物工程有限公司；DPPH，上海生物工程有限公司。

1.1.2 仪器与设备

BS-11隔水式电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；TU-1810型紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；RF5301PC荧光分光光度计，日本岛津；L-8900型氨基酸分析仪，日立Hitachi公司。

1.2 试验方法

1.2.1 米曲霉固态发酵玉米胚芽粕

称取50 g玉米胚芽粕于250 mL锥形瓶中，按一定料液比加入自来水混匀，将米曲霉按一定的接种量接种在玉米胚芽粕中，搅拌均匀，30℃静置发酵一定时间。

1.2.2 玉米胚芽蛋白的提取

用粉碎机将发酵后烘干的玉米胚芽粕粉碎，过筛(100目)，用石油醚浸提方法对其进行脱脂，再采用碱溶酸沉法提取玉米胚芽蛋白，NaOH 浓度为0.08 mol/L，酸沉的pH 为4.7，然后对其进行水洗、中和、冷冻干燥，得玉米胚芽蛋白。

1.2.3 可溶性蛋白含量测定

采用福林酚法测定玉米胚芽蛋白中的可溶性蛋白含量[5]。

1.2.4 表面疏水性测定

参照Hayakawa等[6]的方法评价玉米胚芽蛋白的表面疏水性。

1.2.5 游离巯基含量测定

玉米胚芽蛋白游离巯基含量的测定参考Shimada等[7]的方法进行。用Tris-甘氨酸缓冲液(Tris 0.086 mol/L，甘氨酸0.09 mmol/L，乙二胺四乙酸4 mmol/L，pH 8)配制3 mg/mL的玉米胚芽蛋白溶液，再加4 mg/mL 二硫代硝基苯甲酸(DTNB)0.02 mL，经涡旋混合器迅速混合后在25℃下保温反应10 min，在5 000 r/min离心10 min，取上清液在412 nm处测定吸光度(A412)，以不加样品的试剂溶液作空白。按下式计算游离硫基含量。

SH=73.53×A412×D/C

式中：SH为游离巯基含量，μmol/g；A412为加DTNB时样品的吸光度；D为稀释系数；C为样品质量浓度，mg/mL。

1.2.6 抗氧化性测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率测定

参照Zhang等[8]的方法测定玉米胚芽蛋白DPPH 自由基清除率。

1.2.6.2 还原力测定

取2 mL质量浓度为2 mg/mL的玉米胚芽蛋白溶液，加入2 mL磷酸盐缓冲液、2 mL铁氰化钾溶液，均匀混合，在50℃水浴下保温20 min，再加入2 mL三氯乙酸溶液，振荡摇匀后离心。取上清液2 mL，加入2 mL去离子水和0.4 mL三氯化铁溶液，振荡摇匀后在50℃水浴下保温10 min，在波长700 nm下进行比色。以去离子水代替样品重复以上操作作为空白，同时配制0.1 mg/mL的VC溶液，按照上述方法测定VC的还原力作为标准对比。

1.2.7 氨基酸分析

参考GB/T 5009.124—2003的方法测定氨基酸含量。

2 结果与讨论

2.1 固态发酵单因素试验

2.1.1 发酵时间的确定

称取50 g玉米胚芽粕，在米曲霉接种量4.8×108CFU/g、料液比1∶1条件下，发酵不同时间，提取发酵产物中的玉米胚芽蛋白，测定其可溶性蛋白含量，结果见图1。

图1 发酵时间对玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量的影响

由图1可知，发酵时间对玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量有一定的影响。在固定接种量和料液比的条件下，发酵初期，菌种生长繁殖旺盛，酶含量增多，发酵底物中的大分子有机物水解为小分子物质，发酵产物中可溶性蛋白含量增加。发酵6 h时，可溶性蛋白含量最高，这可能是因为此时酶含量较多，且酶活力最大。发酵6 h后，酶活力下降，不利于水解[9]，可溶性蛋白含量降低。

2.1.2 接种量的确定

称取50 g玉米胚芽粕，在料液比1∶1、发酵时间6 h条件下，改变米曲霉接种量进行发酵试验，提取发酵产物中的玉米胚芽蛋白，测定其可溶性蛋白含量，结果见图2。

图2 接种量对玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量的影响

由图2可知，随着米曲霉接种量的增大，玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量增加，在接种量为6.4×108CFU/g时达到最大，之后随接种量增大可溶性蛋白含量降低。这可能是因为，在一定的接种量范围内，随着接种量的增加，菌种生长繁殖过程中产生的蛋白酶量增多，蛋白质水解生成的肽增加，使玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量增大，但接种量超过一定量后，米曲霉菌数量变大、消耗的营养物质过多，导致米曲霉生长受到抑制，酶活力降低，从而使可溶性蛋白含量降低[10-12]。

2.1.3 料液比的确定

称取50 g玉米胚芽粕，在米曲霉接种量6.4×108CFU/g、发酵时间6 h条件下，改变料液比进行发酵试验，提取发酵产物中的玉米胚芽蛋白，测定其可溶性蛋白含量，结果见图3。

图3 料液比对玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量的影响

由图3可知，在固定发酵时间和米曲霉接种量的条件下，料液比为1∶3时，可溶性蛋白含量最高，之后随料液比增大可溶性蛋白含量降低。分析原因可能是固态发酵水分含量过低，影响营养基质的溶解、传递以及颗粒的润胀，不利于菌体生长。但水分含量过高不利于通气，使基质成团，影响氧的传递和发酵热的散失，不利于蛋白质水解，且米曲霉产生的蛋白酶被稀释，使蛋白酶与底物接触概率下降，影响水解速率，可溶性蛋白含量减少[10]。

2.2 固态发酵正交试验

在单因素试验的基础上，设计三因素三水平的正交试验以优化玉米胚芽粕固态发酵条件，正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验设计及结果

由表2可知，3个因素对可溶性蛋白含量的影响大小依次为B>A>C，发酵的最佳工艺条件为A2B3C1，即发酵时间6 h、接种量7.2×108CFU/g、料液比1∶2.5。在最佳发酵条件下，玉米胚芽蛋白中可溶性蛋白含量为0.827 g/g。

2.3 氨基酸组成分析

以最佳发酵条件下获得的玉米胚芽粕和未发酵的玉米胚芽粕为原料，提取其中的玉米胚芽蛋白，测定玉米胚芽蛋白的氨基酸组成及含量，结果如表3所示。

表3 发酵与未发酵的玉米胚芽蛋白氨基酸组成 %

氨基酸玉米胚芽蛋白未发酵发酵天冬氨酸(Asp)5.057.13苏氨酸 (Thr)∗2.682.96丝氨酸 (Ser)2.763.37谷氨酸 (Glu)8.8410.87甘氨酸 (Gly)3.483.65丙氨酸 (Ala)3.933.90半胱氨酸(Cys)0.160.22缬氨酸 (Val)∗4.334.65甲硫氨酸(Met)∗1.261.25异亮氨酸(Ile)∗2.843.67亮氨酸 (Leu)∗5.986.79酪氨酸 (Tyr)2.362.96苯丙氨酸(Phe)∗3.166.99赖氨酸 (Lys)∗2.993.38组氨酸 (His)2.162.25精氨酸 (Arg)4.624.69脯氨酸 (Pro)3.273.63合计59.8772.36

注：*为必需氨基酸。

由表3可知，发酵后提取的玉米胚芽蛋白较未发酵提取的玉米胚芽蛋白的氨基酸总量提高了12.49个百分点，必需氨基酸含量从未发酵的23.24% 提高到29.69%，只有甲硫氨酸和丙氨酸分别下降了0.01个百分点和0.03个百分点，疏水性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸)总量提高了6.29个百分点。

2.4 游离巯基含量、表面疏水性

以最佳发酵条件下获得的玉米胚芽粕和未发酵的玉米胚芽粕为原料，提取其中的玉米胚芽蛋白，测定玉米胚芽蛋白游离巯基含量和表面疏水性，结果见表4。

由表4可知，经发酵后，提取的玉米胚芽蛋白表面疏水性及游离巯基含量都有所提高，较未发酵提取的玉米胚芽蛋白的表面疏水性和游离巯基含量分别增加了10.3和1.5 μmol/g 。蛋白质是由各种氨基酸相互连接而构成的生物大分子，对蛋白质的生物大分子结构而言，表面疏水性作为影响分子间相互作用的主要因素，对蛋白质功能特性有很大的影响[12-13]。有研究表明蛋白质表面疏水性与蛋白质的疏水性氨基酸总量成正相关，与亲水性氨基酸总量不相关[14]。发酵后蛋白质分子表面的疏水性残基更多地暴露在表面，表现为一定的疏水性，表面疏水性提高。游离巯基反应蛋白质结构的解折叠程度，发酵后提取的玉米胚芽蛋白的解折叠程度增强，分子结构也趋于暴露式，游离巯基含量增大。

表4 发酵与未发酵玉米胚芽蛋白游离巯基含量和表面疏水性

2.5 抗氧化性

以最佳发酵条件下获得的玉米胚芽粕和未发酵的玉米胚芽粕为原料，提取其中的玉米胚芽蛋白，测定玉米胚芽蛋白DPPH自由基清除能力和还原力，结果见图4。

图4 发酵与未发酵玉米胚芽蛋白抗氧化性比较

由图4可知，发酵后提取的玉米胚芽蛋白 DPPH自由基清除率为76.5%，明显高于DPPH自由基清除率为62%的未发酵提取的玉米胚芽蛋白，这是因为高表面疏水性蛋白更容易清除自由基。发酵后提取的玉米胚芽蛋白还原力为0.81，略高于未发酵提取的玉米胚芽蛋白还原力。分析原因可能是因为经发酵酶解后，产生具有还原性的物质，还原力增大[15]。

3 结 论

以玉米胚芽粕为原料，经米曲霉固态发酵后，提取玉米胚芽蛋白。以玉米胚芽蛋白中的可溶性蛋白含量为指标，通过单因素试验和正交试验优化发酵工艺条件，并对发酵前后所提取的玉米胚芽蛋白的理化性质进行对比分析。试验确定最佳发酵工艺条件为：发酵时间6 h，接种量7.2×108CFU/g，料液比1∶2.5。在最佳发酵条件下，玉米胚牙蛋白中可溶性蛋白含量为0.827 g/g。经米曲霉发酵后，提取的玉米胚芽蛋白的表面疏水性、游离巯基含量分别增加了10.3和1.5 μmol/g；氨基酸总量和疏水性氨基酸总量分别提高了12.49个百分点和6.29个百分点；抗氧化性(DPPH自由基清除率、还原力)也有所提高。利用米曲霉发酵玉米胚芽粕显著改善了玉米胚芽蛋白的理化性质，拓宽了玉米胚芽蛋白在食品领域的应用。