改良的QuEChERS/UPLC法测定鱼组织中磺胺甲唑、乙酰磺胺甲唑与甲氧苄啶

刘永涛，韩 刚，宋金龙，董 靖，胥 宁，杨移斌，杨秋红，艾晓辉*

(1.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223；2.农业农村部水产品质量安全控制重点实验室,北京 100141;3.湖北省水产品质量安全工程技术研究中心，湖北 武汉 430223)

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱带紫外检测器(TUV,美国Waters公司)；Mettler-Toledo AE-240电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Hitachi 20PR-520型自动高速冷冻离心机(日本日立公司)；FS-1高速匀浆机(华普达教学仪器有限公司)；调速混匀器(上海康华生化仪器制造厂)；HGC-12氮吹仪(Hengao T&D公司)。

50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)：称取磷酸二氢钠3.12 g溶于蒸馏水，定容至100 mL(A液)；称取磷酸氢二钠7.17 g溶于蒸馏水，定容至100 mL(B液)。量取39 mL A液和61 mL B液混合，定容至400 mL，即得。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼组织的预处理鱼取血后，有磷鱼去除鳞片，取自然比例的带皮肌肉、肝脏、肾脏和鳃等组织，无鳞鱼直接取自然比例的带皮肌肉、肝脏、肾脏和鳃等组织。血液样品以3 500 r/min离心5 min后，取血浆置于离心管中，于-18 ℃冰箱中保存备用；其它样品均质后，于-18 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 鱼血浆样品的处理采用液-液萃取法进行血浆样品的前处理：取血浆样品在室温下自然解冻，准确量取1 mL血浆置于10 mL离心管中。加入1 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)，涡旋振荡30 s，再加入5 mL乙酸乙酯，涡旋振荡30 s，8 000 r/min离心5 min，取上层乙酸乙酯层置于另一10 mL离心管中。向残渣中加入4 mL乙酸乙酯重复提取1次，合并提取液于另一10 mL离心管中，置45 ℃氮吹仪上氮吹至干，加入1 mL初始流动相溶解残渣，涡旋振荡30 s，10 000 r/min离心5 min，液体过0.22 μm针式尼龙滤头后，进行UPLC测定。

1.2.3 自然比例带皮肌肉、肝脏、肾脏和腮组织样品的处理采用改良的QuEChERS方法进行样品前处理：将自然比例带皮肌肉、肝脏、肾脏和腮组织样品在室温下自然解冻，分别称取上述样品2.0 g置于15 mL离心管中，加入6 mL乙腈，涡旋振荡混匀30 s，超声提取1 min，再加入2 g无水硫酸镁，涡旋振荡30 s，8 000 r/min离心5 min，取上清液置于另一15 mL离心管中。向残渣中加入5 mL乙腈重复提取1次，合并提取液于15 mL离心管中，在该离心管中加入500 mg无水硫酸镁和100 mg C18粉涡旋振荡30 s，5 000 r/min离心5 min，将乙腈层转移至15 mL离心管中，置50 ℃氮吹仪上氮吹至干，加入2 mL初始流动相溶解残渣，涡旋振荡30 s，10 000 r/min离心5 min，下层液体过0.22 μm针式尼龙滤头后，进行UPLC测定。

1.2.5 色谱条件色谱柱：Acquity UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；紫外检测波长：270 nm，数据模式：吸光度-基线中值滤波(MBF)模式；流动相：A为甲醇，B为0.1%乙酸水溶液。梯度洗脱程序：0.0～1.0 min，15%A；1.0～2.0 min，15%～25%A；2.0～3.0 min，25%～35%A；3.0～7.0 min，35%A；7.0～8.0 min，35%～15%A；8.0～9.0 min，15%A。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

图1 0.1 mg/L标准溶液(A)与50 μg/kg斑点叉尾鮰自然比例带皮肌肉空白加标(B)的色谱图Fig.1 Chromatograms of 0.1 mg/L standard solution(A) and 50 μg/kg spiked channel catfish muscle and skin in natural proportions(B)

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.2 带皮肌肉、肝脏、肾脏、鳃样品前处理条件的优化对于鱼的带皮肌肉、肝脏、肾脏等样品，干扰测定的主要成分为脂肪和蛋白质等物质。分别考察了甲醇、乙腈和乙酸乙酯作为提取剂的效果，发现甲醇作为提取剂时提取液很难挥干。乙酸乙酯作为提取剂时，提取液中脂肪浓度高，增加了净化难度。而乙腈因对脂肪的提取率低，且可以沉淀蛋白被推荐作为提取剂[19]。本实验最终选择乙腈作为带皮肌肉、肝脏、肾脏、鳃样品的提取剂。

图2 组合净化剂的用量对目标物回收率的影响Fig.2 Effect of combined clean-up reagent amount on the recoveries of target compounds

QuEChERS方法的常用净化剂有无水硫酸镁、C18粉和N-丙基乙二胺(PSA)。其中，无水硫酸镁可除去样品中的水分和沉淀部分蛋白；C18粉可吸附溶液中弱极性的脂肪、多环芳烃等干扰物；PSA主要用于去除糖类、脂肪酸等极性干扰物，但其对磺胺类药物有明显吸附[20]。因此，本实验选择无水硫酸镁作为除水和蛋白沉淀剂，无水硫酸镁+C18粉作为净化剂，除去提取液中的水分和脂肪。以自然比例带皮肌肉组织中加标0.5 mg/kg的回收率作为指标，对无水硫酸镁(200、500、900 mg)和C18粉用量(50、100、150 mg)进行了优化。由图2可知，以500 mg无水硫酸镁+100 mg C18粉为净化剂时的效果最佳，因此选其作为带皮肌肉、肝脏、肾脏、鳃样品的净化剂。

2.2.3 定容溶液的选择分别采用乙腈-甲醇-2%乙酸水溶液(5∶10∶85，体积比)[21-22]和初始流动相甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85,体积比)作为样品残渣的定容溶液，样品定容后过0.22 μm针式尼头滤头进行UPLC分析。结果表明，以前者为定容溶液时，定容液中的杂质对TMP的定量造成干扰。而以甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85)为定容溶液时，3种分析物的峰形对称且无干扰峰(见图1B)。因此，最终选择甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85)为定容溶液。

2.3 方法的线性关系

2.4 回收率、相对标准偏差、检出限与定量下限

分别在5种鱼组织空白样品中添加5个浓度水平的3种目标物混合标准溶液进行回收率实验，每个加标浓度做6个平行，结果见表1。由表1可知，3种目标物的平均回收率为68.2%～97.3%，相对标准偏差(RSD)为1.7%～13%。采用本方法测定加标样品，分别以大于3倍和10倍信噪比计算方法检出限和定量下限，结果显示，3种目标物在5种鱼组织中的检出限均为25 μg/kg，定量下限均为50 μg/kg。参照欧盟对磺胺类药物和甲氧苄啶在自然比例的带皮鱼肌肉中的最高残留限量100 μg/kg和50 μg/kg[12]，本方法的检出限和定量下限均满足检测要求。

表1 鱼组织中磺胺甲唑、乙酰磺胺甲唑和甲氧苄啶的回收率与相对标准偏差(n=6)Table 1 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of SMZ,N-ac-SMZ and TMP in fortified fish tissue samples(n=6)

*standard deviation

2.5 方法应用

3 结 论