二维相关光谱在大米中甲基毒死蜱特征变量优选的应用

胡 潇，黄俊仕，朱晓宇，刘 鹏，吴瑞梅，邱 霞，艾施荣,*

(1.江西农业大学 计算机与信息工程学院，江西 南昌 330045；2.江西农业大学 工学院，江西 南昌 330045；3.江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌 330045)

大米是中国的主要食粮，其品质安全关系到国民健康，但部分农户为了追求经济利益，在水稻种植和贮藏过程中滥用农药，造成大米中存在严重的农药残留问题。甲基毒死蜱(Chlorpyrifos-methyl)是一种高效广谱的有机磷农药，常用于水稻种植中防治病虫害[1]，国家标准规定大米中甲基毒死蜱最大残留量低于5 mg/kg。目前，用于大米中农药残留检测的主要方法有气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等[2-5]，但这些方法存在前处理复杂、耗时长、成本昂贵等缺陷。

表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)因具有前处理简单、耗时短、操作简便、灵敏度高等优点，被广泛用于食品农产品中农药残留的快速检测[6-9]。Luo等[10]利用SERS技术快速检测苹果汁中百草枯残留，分别建立840、1 189、1 294、1 645 cm-14个特征峰标准分析曲线，其最低检测浓度可达0.02 μg/mL。目前，有学者采用化学计量学方法优选多个农药拉曼特征谱峰，建立了食品农产品中农药残留的预测模型，以提高模型的精度和冗余性。翁士壮等[11]采用主成分分析对苹果表面的敌瘟磷拉曼光谱进行特征提取，当主成分为4时，建立支持向量机(SVM)回归模型，模型交互均方根误差最低为0.065 7 mg/L，可准确预测敌瘟磷溶液(100～0.1 mg/L)的浓度。李晓丽等[12]采用融合反向间隔偏最小二乘、竞争性自适应重加权算法和连续投影算法对龙井茶中美术绿的拉曼光谱特征波段进行深入挖掘，优选出14个特征波数，建立最小二乘支持向量机定量分析模型，模型预测集的决定系数达到0.94，均方根误差为0.535。也有研究采用二维相关光谱(Two-dimensional correlation spectroscopy，2DCOS)将拉曼光谱中的一些重叠峰和弱峰凸显出来，以提高光谱分辨率。该方法将常规光谱信号扩展到二维，根据研究目的选择特定的外扰因素，诱发光谱信号发生动态变化，解析其二维同步光谱图和自相关谱图，观察光谱对外扰的变化情况，研究了各组分基团分子振动行为的差异，以寻找出与外扰密切相关的特征谱峰[13-14]。

本文利用SERS技术结合二维相关光谱方法快速分析大米中甲基毒死蜱农药残留。采用2DCOS方法提取大米中甲基毒死蜱SERS谱图的特征信息，以甲基毒死蜱浓度为外扰，进行二维相关同步光谱和自相关谱解析，筛选出与甲基毒死蜱浓度变化密切相关的特征谱峰，建立了大米中甲基毒死蜱残留的SVM定量分析模型，从而为大米中农药残留快速检测装置的研发提供了方法支持。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

便携式拉曼光谱仪(RamTracer-200-HS，美国欧普图斯光学纳米科技有限公司)，低速离心机(JW-1024 ，安徽嘉文仪器装备有限公司)，气相色谱-串联质谱(Agilent GC 7000，美国安捷伦科技有限公司)，N-丙基乙二胺(PSA，天津博纳艾杰尔科技有限公司)，C18(北京迪马科技有限公司)，甲基毒死蜱(98.5%，国家标准物质中心)，滤膜(13 mm、0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司)，乙腈(分析纯)、氯化钠(99.5%)、无水硫酸镁(98.0%)购于国药集团化学试剂有限公司，阴性大米样本由江西省出入境检验检疫局提供，金纳米溶胶于实验室自制；实验用水为蒸馏水。

1.2 甲基毒死蜱农残样本的制备

1.2.1 甲基毒死蜱溶液的制备准确称取10 mg甲基毒死蜱标准品，置于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到质量浓度为100 mg/L的甲基毒死蜱标准溶液，备用。

1.2.2 模拟甲基毒死蜱农药残留样本的制备取82份阴性大米样本，每份10 g，编号1～82，晒干。用乙腈将质量浓度为100 mg/L甲基毒死蜱标准溶液稀释成82个不同浓度梯度，范围为0.1～76 mg/L，每份10 mL，将82个不同浓度的甲基毒死蜱标准溶液均匀喷洒至对应编号大米样本，放置干燥阴凉处晾干后，用粉碎机粉碎，过40目筛，备用。

1.2.3 含农残大米样本前处理提取：称取5 g含农药残留大米粉末于50 mL离心管中，依次加入10 mL水、10 mL乙腈、5 g氯化钠，振荡涡旋2 min后，4 200 r/min离心5 min。

净化：称取300 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18于10 mL离心管中，取2 mL上清液加至上述离心管中，涡旋1 min后，4 200 r/min离心5 min，提取上清液，过0.22 μm滤膜，用于拉曼光谱的检测。

1.3 气相色谱-串联质谱测定条件

色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：250 ℃；升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至200 ℃，保持0 min；以16 ℃/min升至280 ℃，保持7 min后运行；载气：氦气；载气流速：1.2 mL/min；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样。

质谱条件：离子源：EI源；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：280 ℃；传输线温度：280 ℃；碰撞气：氮气；采集模式：选择离子扫描(SRM)。以上实验条件用于测定样本的实际浓度。

1.4 甲基毒死蜱分子理论模拟

采用Gaussview软件构建甲基毒死蜱分子结构，运用Gauss03对其进行计算，计算方法为B3LYP，基组设置为6～31G，由Gaussview打开计算结果，得到甲基毒死蜱分子理论上的拉曼光谱。

1.5 表面增强拉曼光谱采集

取500 μL金胶、40 μL甲基毒死蜱溶液和100 μL 1%的氯化钠溶液加至2 mL石英进样瓶，混合均匀后，上机检测。每个样本测量3次，取平均值。

1.6 数据分析

根据大米样本的二维同步谱图和自相关谱图优选出与甲基毒死蜱残留浓度密切相关的特征谱峰，建立了大米中甲基毒死蜱残留的SVM分析模型。采用SNV预处理原始光谱后，以甲基毒死蜱浓度为外扰变量进行二维相关光谱(2DCOS)分析，得到同步二维相关谱图和自相关谱图。同步二维相关谱图关于主对角线(Diagnosis line)对称，处于主对角线上的谱峰为自相关峰(Auto-peak)。自相关峰表示化学基团对甲基毒死蜱浓度微扰的敏感程度，以同步二维相关谱图中的等高线反映其自相关峰的强弱，即自相关谱图的峰强度越高，表明该谱峰对甲基毒死蜱浓度越敏感。结合等高线密集中心点位置和自相关谱峰强度即可确定与甲基毒死蜱浓度密切相关的特征峰[13,15]。

以训练集相关系数(RC)、训练集均方根误差(Root mean square error of calibration，RMSEC)、预测集相关系数(RP)、预测集均方根误差(RMSEP)和相对分析误差(RPD)评价模型性能和精度。当RPD大于3.0时，说明模型性能可靠，预测精度好，可用于实际样品的估测[16]。

图1 甲基毒死蜱的理论光谱(a)、5 mg/L甲基毒死蜱标准溶液(b)及乙腈(c)的SERSFig.1 Theoretical Raman spectrum of chlorpyrifos-methyl(a)，SERS of 5 mg/L chlorpyrifos-methyl standard solution(b) and acetonitrile(c)

2 结果与讨论

2.1 甲基毒死蜱农药分子理论计算光谱与实验光谱分析

图1分别为甲基毒死蜱的理论计算光谱(曲线a)，5 mg/L甲基毒死蜱标准溶液(曲线b)及乙腈(曲线c)的表面增强拉曼光谱。从图中可看出，在454、610、672和1 180 cm-1处，实验谱峰与理论计算谱峰完全一致，在582、988、1 268、1 320 cm-1处实验谱峰与理论计算谱峰相比略有偏移，而在1 082 cm-1处观察到的理论谱峰并未在实验光谱中出现。这是因为理论模拟谱峰是在理想状态下对单个分子进行模拟仿真计算，并未考虑分子间作用力的影响，而实验谱峰中则在甲基毒死蜱与溶剂分子间存在相互作用力，从而导致部分实验谱峰与理论计算谱峰略有偏移，以及部分谱峰在理论计算和实验中未同时出现等现象[17]。

图2 20 mg/L甲基毒死蜱标准溶液(a)、大米提取液中10.09 mg/kg甲基毒死蜱农药残留(b)、阴性大米样本(c)及乙腈(d)的SERSFig.2 SERS of 20 mg/L chlorpyrifos-methyl standard solution(a),10.09 mg/kg chlorpyrifos-methyl from rice extraction(b),negative matrix of rice extraction(c) and acetonitrile(d)

2.2 大米中甲基毒死蜱残留的分析

图2分别为20 mg/L甲基毒死蜱标准溶液(曲线a)、大米提取液中10.09 mg/kg甲基毒死蜱农药残留(曲线b)、阴性大米样本(曲线c)及乙腈(曲线d)的SERS。基于“2.1”可知，图2b在454、582、610、672、1 268 cm-1处出现了甲基毒死蜱分子的特征谱峰。经解谱可知，990 cm-1归属于CH3—O—P上P—O—C的伸缩振动，与上文988 cm-1归属相同，也属于甲基毒死蜱的特征峰，对比图2c和图2d，这些特征谱峰并未与大米和乙腈的拉曼谱峰重叠，由此可选择这些特征峰用于大米中甲基毒死蜱的定性定量分析。

2.3 基于二维相关光谱特征变量优选

图3A为82个大米样本的原始拉曼光谱，可观察到图中存在基线漂移等噪音干扰，采用SNV对原始光谱进行预处理，预处理后的光谱如图3B。

采用2DCOS方法从大米的拉曼光谱中优选出多个农药特征谱峰，图4为其同步二维相关谱图(图4A)及自相关谱图(图4B)。由图4A可知，在400～1 400 cm-1波长范围中，较强自相关峰为主对角线上等高线密集中心点位置处，即610、672、988、1 268 cm-1波长处；由图4B知，上述波长处对应位置均为波峰。综上，采用2DCOS方法优选出的4个特征谱峰为610、672、988、1 268 cm-1，该结果与实验分析结果(见“2.2”)完全相同，且与Shende等[18]的研究结果相吻合，说明采用2DCOS方法优选的610、672、988、1 268 cm-1特征峰是甲基毒死蜱分子的特征谱峰。

图3 原始光谱(A)及SNV预处理后的光谱(B)Fig.3 Original spectra(A) and spectra after SNV pre-treatment(B)

图4 大米中甲基毒死蜱的二维相关光谱(A)与自相关谱(B)Fig.4 Two-dimensional correlation synchronization spectrum(A) and diagnosis spectrum(B) of chlorpyrifos-methyl residue in rice sample

图5 CARS提取特征波数过程图Fig.5 CARS extraction characteristic variables processA：trend of wavelength number,B:trend of RMSECV,C:trend of wavelength variable regression coefficient

图6 SVM模型预测值与实测值的散点图Fig.6 Scatter plots of predicted and measured values of SVM modelA:calibration set;B.prediction set

2.4 SVM模型建立与性能比较

从82个样本中选出55个组成校正集用于建立模型，剩余27个作为预测集用于测试模型性能。基于2DCOS优选的4个特征谱峰，建立了大米中甲基毒死蜱残留浓度的SVM模型，模型建立过程中，采用网格搜索和五折交叉验证法对惩罚系数c和核函数g进行优化，确定c和g分别为44.68和8.36。图6为建立的大米中甲基毒死蜱残留SVM模型校正集和预测集的预测值与实测值散点图，模型对校正集RC为0.98，RMSEC为3.94，y=0.945 2x+1.467 6;对预测集RP为0.96，RMSEP为5.21，RPD为3.66，其值大于3，y=0.979 7x+0.519 0。说明模型可用于大米中甲基毒死蜱残留的实际估测。

表2为基于全光谱、CARS优选的11个特征变量及基于2DCOS优选的4个特征变量所建偏最小二乘回归(Partial least squares,PLS)和SVM模型。由表可知，基于2DCOS优选的特征变量所建模型的预测能力优于基于CARS和全光谱所建的模型，而基于CARS的则优于基于全光谱的，这是因为由2DCOS筛选的甲基毒死蜱的特征峰参与了建模，提高了模型精度和预测能力，而全光谱区包含了大量与甲基毒死蜱分子无关和冗余的信息，CARS也优选了少数与甲基毒死蜱分子无关的信息参与建模，从而影响了模型的精度和稳定性。此外，2DCOS方法仅优选4个特征峰建模就能达到最优预测效果，占全光谱变量的0.8%，模型得到简化。由表2还可知，所建SVM模型性能优于PLS模型，其RPD值均高于3，可用于实际估测，说明大米中甲基毒死蜱的拉曼光谱变量与甲基毒死蜱农药的浓度之间倾向于非线性关系。

表2 模型结果的比较Table 2 Comparison between the results of different models

*principal component numbers(主成分数)

表3 大米中甲基毒死蜱农药的SVM模型预测值与实测值的比较Table 3 Comparison between predicted values and measured values of chlorpyrifos-methyl residue in rice based on SVM

2.5 模型准确性与可靠性评价

为验证SVM模型的准确性，对5个未知浓度大米样本进行检验，计算其回收率和相对误差，结果见表3。由表可知，5个大米样本的预测回收率为96.2%～102%，且预测值与实测值相对误差的绝对值为0.07%～3.8%，说明模型预测值与实测值基本一致，表明所建模型可用于大米中甲基毒死蜱农药残留的检测。对这5个大米样本的预测值与实测值做配对t检验，t=2.082，其绝对值小于t0.05,4=2.776(95%显著性水平)，说明模型预测值与实测值之间无显著差异，表明所建模型应用于大米中甲基毒死蜱农药残留的实际检测，结果准确可靠。

3 结 论

本文基于2DCOS方法，以甲基毒死蜱浓度为外扰，对预处理后大米样本的拉曼光谱进行了二维相关同步光谱和自相关谱解析，筛选出4个与甲基毒死蜱浓度变化相关的特征谱峰(610、672、988、1 268 cm-1)，这些特征谱峰与实验分析结果完全吻合。与CARS特征优选相比，2DCOS方法更能提高光谱分辨率，且能优选出与大米中甲基毒死蜱农药残留密切相关的特征谱峰。表明SERS结合2DCOS技术可对甲基毒死蜱的特征波长进行有效筛选，从而简化模型，也为拉曼光谱分析中筛选特征变量提供了新的思路和方法。利用2DCOS优选的特征变量建立SVM和PLS模型，得出SVM非线性模型性能优于线性PLS模型，且SVM模型可用于大米中甲基毒死蜱农药残留的快速检测。