聚合物涂层在毛细管电泳分离蛋白中的研究进展

陈丽娟，闫叶寒，朱海锟，Muhammad Atif

(1.皖西学院 材料与化工学院，安徽 六安 237012；2.中国科学技术大学 化学与材料科学学院，安徽 合肥 230026)

毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)是20世纪80年代发展起来的一种新型分析技术，具有分析时间短，分离效率高，样品消耗量少等优点，常用于复杂样品的分析研究[1-3]，在分离科学发展史上具有划时代意义[4-5]。CE的工作原理是：以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，根据被分析物各组分间淌度和迁移时间分配上的不同实现分离。在CE分析中，所用的毛细管一般是石英玻璃材质，毛细管内壁硅羟基(Si—OH)的覆盖密度约为4.5/nm2[6]，CE分离时的背景缓冲液pH值范围较宽(pH 3.0～9.0)，当背景缓冲液的pH值超过毛细管内壁Si—OH的等电点(pI=2～3)时，Si—OH将会发生解离，离子化为带负电荷的硅氧基(Si—O-)，这种带负电荷的毛细管内表面将导致缓冲液中阳离子吸附到内壁表面形成双电层，并在电场作用下形成电渗流(EOF)[7]；另一方面，在对生物样品如蛋白质的分离过程中，带正电荷的碱性蛋白质与带负电荷的毛细管内壁之间存在强烈的静电相互作用，蛋白质一旦吸附在毛细管内壁即会出现信号峰展宽、拖尾，甚至难以检测出信号峰的现象[8]。为解决这一问题，目前的研究热点是在毛细管内壁涂覆上一层聚合物抗污涂层(抗蛋白质吸附，抗菌功能的涂层)，以有效阻抗蛋白质的吸附，减弱蛋白质与毛细管内壁的相互作用，同时有效抑制或调控EOF，在很大程度上优化CE的分离效果。根据聚合物涂层与毛细管内壁之间结合方式的不同，可将毛细管分为动态涂层毛细管和静态涂层毛细管[9]，示意图见图1。

图1 动态涂层(A)及静态涂层(B)示意图[10]Fig.1 Dynamic(A) and static(B) capillary coatings[10]

1 聚合物抗污涂层材料

2 毛细管动态涂层

毛细管动态涂层通常是在CE运行的背景缓冲液中加入水溶性抗污聚合物来实现，这些聚合物可以优先吸附在毛细管内壁，快速建立吸附-解吸平衡，实现对毛细管内壁的有效覆盖，从而调控EOF和减弱蛋白质在毛细管内壁的吸附。所加入的水溶性聚合物可以是中性聚合物PEG、PVA、PVP、羟乙基纤维素等，也可以是阳离子型的聚合物。这些水溶性聚合物的加入能够在一定的pH值范围内有效抑制或调控电渗流，提高蛋白质的分离效率以及分离的稳定性。Zhao等[33]合成了一系列季胺化的纤维素(Quaternized celluloses,QC)，并将其作为阳离子型的聚合物添加入CE背景缓冲液中，在添加剂量为3 μg/mL时获得稳定的反向电渗流。他们进一步对QC的分子量、阳离子化程度以及背景缓冲液pH值等进行了研究，发现QC动态涂层对蛋白质的分离时间依赖于QC的分子量和阳离子化程度。该涂层能够在25 min内，于pH 5.0～8.0区间实现5种蛋白质(溶菌酶、核糖核酸酶A、细胞色素c、牛胰蛋白酶抑制剂、α-凝乳蛋白酶原A)混合样品的有效分离。

表1 文中所述的毛细管内壁修饰聚合物涂层材料、分离样品及分离效率Table 1 The polymer coating materials used,the separating sample and the separating efficiency described in the paper

static coatingsⅠlists the noncovalent polymer coatings;static coatings Ⅱlists the covalent polymer coatings;static coatings Ⅲ lists polydopamine based polymer coatings

近些年来发展了一种新型的聚合物离子液体动态涂层材料，所谓聚合物离子液体(PILs)是指集离子液体与聚合物结构于一身的一类聚合物材料，通常可通过小分子离子液体单体的聚合制备得到[34-35]。典型的基于N-乙烯基咪唑盐单体的聚合反应制备离子液体的反应示意图如图2所示。该种结构的聚合物离子液体由于带有正电荷，能够与带负电荷的毛细管内壁结合，从而使得毛细管内壁涂敷上一层带正电荷的聚合物涂层，因此会呈现出反向的电渗流特性。

图2 N-乙烯基咪唑盐单体的聚合反应制备聚合物离子液体[32]Fig.2 General synthetic route to PILs from N-vinylimidazolium-based IL monomers[32]

Li等[36]利用聚合物离子液体的这一特性制备得到了一种动态涂层毛细管，他们合成了一种阳离子型聚合物离子液体——聚(1-乙烯基-3-丁基咪唑溴)(Poly(1-vinyl-3-butylimidazolium)bromide)，并发现该类聚合物离子液体动态涂层在pH 3.0～9.0范围内呈现出良好稳定的反向EOF[37]，利用该特性能够有效抑制分析物在毛细管内壁的吸附，即使是碱性蛋白混合样品也能够实现有效分离，蛋白质峰的分离效率甚至达到247 000 ～540 000 plates/m，3次连续分离迁移时间的平均标准偏差低于0.37%[38]。毛细管动态涂层具有可再生的优点，涂层制备方法简单，但是相较于毛细管静态涂层，其对蛋白质的分离效率以及涂层的稳定性能均有待进一步优化。

3 毛细管静态涂层

毛细管静态涂层通常是CE运行之前就已经在毛细管内壁修饰上的聚合物涂层材料，可直接用于电泳分析，CE运行背景缓冲液中无需再添加其他物质。较动态涂层而言，该类型涂层对蛋白质的分离效率，及其自身稳定性均有所提高，因而也是目前的研究热点[39]。毛细管静态涂层根据聚合物材料与毛细管内壁结合形式不同又可分为非共价键涂层和共价键涂层两大类。

3.1 非共价键涂层

涂层材料通过与毛细管内壁硅羟基之间的氢键、离子键或者疏水相互作用等方式结合而得到的涂层统称为非共价键涂层或半永久性涂层，毛细管内非共价键涂层的制备方法一般较为简单易行，且具有涂层可再生的优点[40-41]。Yang 等[42]通过将羟乙基纤维素部分阳离子化(Cationized hydroxyethylcellulose,cat-HEC)制备了一种阳离子涂层，并成功用于3种碱性蛋白质(溶菌酶、核糖核酸酶A、细胞色素c)混合样品的有效分离。Shi等[43]通过在羟乙基纤维素骨架接枝聚乙二醇(HEC-g-PEG)，使羟乙基纤维素与毛细管内壁结合，再利用PEG的抗蛋白质吸附性能制备得到抗污涂层管。该聚合物涂层在较宽的pH值和温度范围内稳定，能够实现4种碱性混合蛋白质和酸性、中性、碱性6种蛋白质混合样品的有效分离，其中HEC-g-PEG750 涂层管的分离效率和分离重现性最好。Xing等[44]通过原子转移自由基聚合(ATRP)法合成了一种四臂聚合物PEG3-PDMA，其中三臂是具有抗污能力的PEG，另外一臂为具有涂覆能力的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA)，该聚合物形成的涂层管能够有效抑制电渗流，实现细胞色素c、溶菌酶以及核糖核酸酶A混合物的有效分离。Xu等[45]通过ATRP的方法制备了一种三嵌段聚合物——聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚乙二醇-b-聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA-b-PEG-b-PDMA)，该聚合物对毛细管内壁具有很好的涂覆效果，尤其是其中的PDMA链段可与毛细管内壁通过疏水相互作用结合，是一种有效的涂层材料，该涂层毛细管可以实现碱性蛋白质混合样品的有效分离以及酸、中、碱性3种类型蛋白质混合样品的有效分离。朱小玺等[46]通过ATRP法合成了聚(4-乙烯基吡啶)-b-聚乙二醇-b-聚(4-乙烯基吡啶)三嵌段聚合物(P4VP-b-PEG-b-P4VP)，该三嵌段聚合物中的P4VP部分可以与毛细管内壁的硅羟基通过发生物理相互作用(静电相互作用)制备物理涂层管，并且该涂层具有pH值敏感性，可以通过调节缓冲液的酸碱度来调控EOF以及优化对碱性蛋白质的分离度和分离时间。Cao等[47]制备了一系列的离子型抗污聚合物，并通过物理涂敷的方法制备了相应的物理涂层毛细管，该毛细管呈现出非常优异的蛋白质分离性能。他们通过普通自由基聚合的方法制备了羟乙基纤维素接枝聚(甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯)(HEC-g-PDMAEMA)，通过ATRP法制备了聚(甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯)-b-聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯)(PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA)三嵌段共聚物，并对该聚合物上PDMAEMA链段上的叔胺季铵化处理得到阳离子型抗污聚合物[48]，该聚合物可以通过静电相互作用以及氢键作用结合在毛细管内壁。他们还通过可逆加成断裂链转移(RAFT)反应合成了甲基丙烯酸甲酯磺基甜菜碱(SBMA)与N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)的无规共聚物(poly(DMA-co-SBMA))，该聚合物上的DMA部分具有很好的自涂敷性能，SBMA部分具有很好的抗蛋白质吸附性，该种类型的毛细管抗污涂层可以在10 min内实现对4种碱性蛋白的快速分离，分离效率最高可达1 509 000 plates/m[49]。

3.2 共价键涂层

涂层材料与毛细管内壁之间通过共价键结合而形成的涂层统称为共价键涂层。共价键涂层具有良好的稳定性，其涂层技术一般包括毛细管的预处理、活性基团的引入、目标涂层聚合物的引入等多个步骤，涂层制备工艺较为繁琐，涉及的化学反应多，耗时长，而且有可能使涂层制备的重复性变差，但是这并没有阻碍共价键涂层的发展。Razunguzwa等[50]通过PEG大分子硅烷偶联剂与毛细管内壁的反应制备了共价键合的PEG涂层，该涂层能够用于牛血清蛋白、细胞色素c、溶菌酶以及肌红蛋白混合样品的有效分离。Xu等[51]通过硅烷化试剂，首先在毛细管内壁引入氨基官能团，然后使其与戊二醛反应引入醛基官能团，最后利用PVA与醛基间的缩醛化反应，将PVA以共价键合的方式结合在毛细管内壁制备得到共价键合涂层，该涂层在pH 3.0～10.0的区间内可有效抑制EOF，并且能够在pH 3.0～5.0区间实现阳离子型蛋白质(包括：细胞色素c、溶菌酶、胰凝乳蛋白酶原)以及pH 10.0时阴离子型蛋白质(包括：肌红蛋白、胰蛋白酶抑制剂)的有效分离，该共价键合涂层在连续分离100次后，迁移时间的相对标准偏差(RSD)仍小于0.9%。以上共价键合法制备的涂层结合了PVA和PEG的抗蛋白质吸附性能以及共价键的稳定性能，故而呈现出优异的分离性能和稳定性能，但是涂层的制备方法过于复杂。此外，常用于毛细管内壁修饰的硅烷偶联剂多是有毒且湿度敏感性物质，在使用的过程中不可避免会引起环境问题以及涂层管质量问题。如何将共价键涂层的优良性能与简易的涂层制备技术相结合是当下的研究热点。

以上介绍的是基于热交联方式制备的共价键涂层毛细管，近年来，紫外光交联也为共价键合毛细管的研制提供了新的研究思路。该方法通过制备一种光敏性重氮聚合物，利用重氮聚合物上的正电荷与毛细管内壁硅氧基的负电荷之间的静电相互作用(pH>3.0)或氢键作用将其吸附在毛细管内壁[54]，然后再利用重氮聚合物上的正电荷与带有负电荷的抗污聚合物间的相互作用，将抗污聚合物通过静电相互作用结合在毛细管内壁。在此过程中，光敏性的重氮聚合物主要起到中间层的作用，最后该静电吸附涂层在紫外光下进行交联，离子键转化为共价键得到共价键涂层，该类涂层毛细管呈现出良好的化学稳定性和蛋白质分离性能。Yu等在这一领域做了大量工作，典型的基于光敏性重氮树脂(DR)与环糊精树枝状大分子(CD-dendrimer)制备共价键涂层毛细管的流程如图3 所示[55]。他们基于分子间的静电相互作用逐步将DR和CD-dendrimer涂敷于毛细管内壁，然后在紫外光的交联作用下离子键转化为共价键，从而构建了DR/CD-dendrimer共价键涂层。该种涂层能够实现碱性蛋白质的有效分离，5次连续分离迁移时间的RSD<2.5%，连续60次分离迁移时间的RSD<3.0%，3根毛细管分离迁移时间的RSD<3.0%。实验结果表明：该涂层管呈现出较好的稳定性能，方法具有可行性。此外，他们还基于毛细管内壁与DR间的静电相互作用以及DR与聚甘油树枝状大分子(PG-dendrimer)间的静电相互作用制备得到了DR/PG-dendrimer共价键涂层毛细管。该种涂层管呈现出优异的稳定性能和分离效率，在20 min时间内能够实现溶菌酶、牛血清白蛋白、肌红蛋白以及核糖核酸酶A的有效分离，并且连续分离280次后的迁移时间和分离效率均无明显改变[56]。最近，他们通过ATRP法合成了聚乙烯醇与聚苯乙烯的两嵌段聚合物poly(VA-b-St)，通过在苯乙烯对位上引入重氮结构，制备了重氮化聚乙烯醇-b-苯乙烯(diazo-poly(VA-b-St))。该重氮聚合物同样可以通过静电自组装以及紫外光致离子键转化共价键制备diazo-poly(VA-b-St)涂层毛细管，该涂层管能够实现溶菌酶、牛血清白蛋白及核糖核酸酶A混合样品的有效分离[57]。以上新型共价键涂层的制备方法为涂层毛细管的研制提供了新思路，也为毛细管电泳的应用开拓了新领域。近些年发展起来的基于多巴胺/聚多巴胺生物粘合剂制备的一系列聚合物涂层毛细管同样在毛细管分离领域具有很大的应用价值。

图3 制备重氮树脂/环糊精树枝状大分子共价键合涂层管示意图[55]Fig.3 Schematic illustration of preparation process of covalently bonded DR/CD-dendrimer coatings on capillary surface[55]

3.3 聚多巴胺涂层

自2007年被报道至今，仿生贻贝类聚多巴胺涂层在各领域得到了广泛应用[58-59]。聚多巴胺涂层作为一种万能生物粘合剂，可以吸附于各种材料表面，并且聚多巴胺表面由于苯醌等基团的存在，可以与带有活泼氢的氨基/巯基发生迈克尔加成/希夫碱反应，从而可通过对聚多巴胺涂层进行二次修饰制备各种功能的涂层表面，此方法称为聚多巴胺的二步涂敷法。此外基于多巴胺与功能性共聚物的一步共混沉积制备功能性表面的方法也得到了广泛应用[60-63]。由于聚多巴胺与基底之间的黏附机理比较复杂，至今尚无公认的说法，因此，基于多巴胺/聚多巴胺修饰的涂层管另归一类进行讨论[64]。

图4 PMOXA-EI与DA一步共混制备抗污涂层管及用于奶粉中三聚氰胺的检测[74]Fig.4 Schematic illustration of coatings deposited on the inner-wall of fused-silica capillary using DA and PMOXA-EI[74]

基于多巴胺/聚多巴胺涂层制备的聚合物涂层毛细管还有很多种类[76]，它们均表现出较好的分离稳定性和分离效率，但是多巴胺/聚多巴胺与毛细管内壁的结合形式以及与聚合物之间的相互作用机理解释至今还处于研究中，有待进一步阐述和深入研究应用[77-80]。

4 总结与展望

在CE分析领域，毛细管柱是核心，涂层毛细管的好坏直接关系到电泳分离的稳定性以及分离效率，所以更好地完善毛细管涂层能够进一步推动毛细管电泳的发展，结合以上毛细管涂层的研究进展，一种好的涂层技术应该是简单易行，环保绿色的。此外，一种普适性的聚合物涂层材料应该具有以下特点：(1)聚合物具有一定的亲水性，能够形成水合层，抑制目标分析物在毛细管内壁的吸附；(2)聚合物能够在毛细管内壁形成均匀的涂层,有效屏蔽硅羟基，调控电渗流；(3)聚合物涂层的pH值适应性强，能够在较宽的pH值范围内维持稳定。