基于智能手机定量检测多种心肌指标物浓度的方法研究

李 伟,陈淑静,戴 博*,郑璐璐,刘 华

(1.上海理工大学 光电信息与计算机工程学院,光学仪器与系统教育部工程研究中心,上海 200093；2.上海交通大学附属胸科医院 心内科,上海 200030)

心血管疾病是危害人类健康的一大杀手,是慢性病的主要致死原因之一。研究报告显示,2016年因心血管疾病死亡的人数超过1 790万,占全球死亡人数的31%,预计到2030年死亡人数将增加至2 360万[1-3]。然而,只要早期诊断、监测合理,大多数心血管疾病是可以预防和治愈的[4-5]。因此,亟待建立一种低成本、操作简单的技术用于心血管疾病的诊断和监测。目前,检测患者体内心肌指标物的含量是诊断心血管疾病的常规方法,如通过检测心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)的含量对急性心肌梗死症状进行诊断,检测心肌肌钙蛋白I/心肌肌钙蛋白T(cTnI/cTnT)含量可诊断慢性心力衰竭。最新研究表明,基质金属蛋白酶-9(MMP9)、生长刺激表达基因2蛋白(ST2)和正五聚蛋白3(PTX3)是诊断特发性心房颤动中的心脏损伤、心力衰竭和急性心肌梗死症状的循环生物标志物[6-8]。MMP9是由巨噬细胞或炎性细胞分泌的基质金属蛋白酶家族蛋白的成员,与心肌损伤和血管动脉瘤[9-11]等许多心血管疾病密切相关。ST2是由重组人白介素1受体样1(IL1RL1)基因编码的白细胞介素1家族蛋白成员,其响应于心力衰竭或心肌梗塞的恶化[12-14]。PTX3是由巨噬细胞和树突细胞响应初级炎症刺激产生的长五聚蛋白。心肌梗死后患者血清中PTX3水平会迅速上升[15-17]。因此,即时检测MMP9、ST2和PTX3的含量对心血管疾病的诊断具有重要意义。

随着科学技术的飞速发展,手机的功能也在不断完善,从传统功能单一的通信设备变得越来越智能化。不仅如此,智能手机的普及率也越来越高,手机被人们用来拍照、跟踪定位、收发信号、分析处理数据等[18]。由于智能手机成本较低、体积小巧、功能多样,研究者开发了许多基于智能手机的检测诊断设备[19-21]。如应用智能手机进行pH值检测[22-23]、生物标记物检测[24-25]、胃肠炎检测[26]、疟疾检测[27]等。因此,借助智能手机,建立一种低成本并且简单快速检测心肌指标物的方法也逐渐成为可能。

本文建立了一种基于智能手机比色法定量检测MMP9、ST2和PTX3 3种心肌指标物浓度的检测系统,通过手机对反应溶液拍照,拍照结果上传服务器后采用比色算法分析处理,再将检测结果返回显示在手机界面上。通过对实际血清样品进行检测,并与商用酶标仪检测结果进行对比,验证了系统的可行性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

人MMP9免疫测定试剂盒(产品目录号VAL113)、人ST2/IL-33 R免疫测定试剂盒(产品目录号VAL114)和人Pentraxin 3/TSG-14免疫测定试剂盒(产品目录号DPTX30)均购于美国R&D Systems，上述试剂盒内均包含聚苯烯微孔条、一抗、酶标检测抗体、指标物标准品、检测液、浓缩稀释液、浓缩洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止液、封板胶纸。移液枪(德国艾本德公司)；Infinite M200商用酶标仪(瑞士Tecan公司)；白光贴片式LED(湖北匡通电子股份有限公司)；匀光片(雄达塑胶亚克力厂)。

测试使用智能手机为iPhone 5,该手机使用标准的红、绿、蓝CMOS图像传感器,拍照时相机的白平衡和ISO感光度设置成固定值,快门速度设置为1/2584 s。

1.2 心肌指标物酶联免疫吸附试验

按照试剂盒中说明书要求配制好稀释液、洗涤液和标准品。对于血清样本均预先进行100倍稀释,确保稀释后的血清样本光吸收度和蓝色通道下的响应值在标准曲线范围内。

1.2.1 MMP9酶联免疫吸附试验首先向包被上一抗的微孔中加入100 μL检测液,再将100 μL样本加入相应的微孔中,用封板胶纸封住微孔,室温下孵育2 h。孵育完成后将微孔洗涤4次,向相应的微孔中加入200 μL酶标检测抗体,室温下孵育60 min。孵育完成后将微孔洗涤4次,向微孔中加入200 μL底物溶液,并将微孔在室温下避光孵育30 min。最后向相应的微孔中加入50 μL终止液,于15 min内测量反应产物。

1.2.2 ST2酶联免疫吸附试验首先向包被上一抗的微孔中加入50 μL检测液,再将50 μL样本加入相应的微孔中,用封板胶纸封住微孔,室温下孵育2 h。孵育完成后将微孔洗涤4次,向相应的微孔中加入100 μL酶标检测抗体,室温下孵育2 h。孵育完成后将微孔洗涤4次,向微孔中加入200 μL底物溶液,并将微孔在室温下避光孵育30 min。最后向相应的微孔中加入100 μL终止液,于15 min内测量反应产物。

1.2.3 PTX3酶联免疫吸附试验首先向微孔中加入200 μL一抗,室温下孵育60 min。孵育完成后微孔洗涤2次,将100 μL的防腐剂加入血清样本中进行预处理。然后每孔加入100 μL检测液,再将20 μL样本加入相应的微孔中,用封板胶纸封住微孔,室温下孵育2 h。孵育完成后将微孔洗涤4次,向相应的微孔中加入200 μL酶标检测抗体,室温下孵育2 h。孵育完后将微孔洗涤4次,向微孔中加入200 μL底物溶液,并将微孔在室温下避光孵育30 min。最后向相应的微孔中加入50 μL终止液,在15 min内测量反应产物。

将需要检测的微孔置于96微孔板上,然后将微孔板放入商用酶标仪内检测,检测主波长设置为450 nm,辅助波长为540 nm。以商用酶标仪的测出结果为金标准,并与后续研制的检测系统测出的读数进行比对。

1.3 检测系统搭建

自制微孔条照明器件的三维示意图及LED灯光谱图见图1A。微孔条照明器件底部放置一块LED阵列电路板,共8盏LED灯,每盏LED灯正对着4个微孔的正中心。LED的性能通过积分球系统(杭州浙大三色仪器有限公司)进行分析测量,LED灯的光谱覆盖可见光范围,即380～780 nm,主波长为480 nm。电路板上方装有双面磨砂2 mm厚的匀光片,匀光片的透射率为88%,透射雾度为98%。匀光片可以让LED发射的灯光均匀照亮每个微孔的底部。匀光片上方利用3D打印技术,打印出一个有着4×8形式的栅格,用来安装微孔条便于检测。微孔条中每个微孔的容量为400 μL,微孔直径为6.8 mm,高度为12 mm,孔壁厚度为0.65 mm,微孔均为圆孔平底,材质为聚苯乙烯。照明器件的实物图如图1B所示,整个照明器件由两节7号电池供电,长度为73 mm,宽度为54 mm,高度为37 mm,重量为56 g。

搭建的检测系统三维示意图如图1C所示。检测时,微孔条照明器件被打开,在微孔条照明器件外放置一个3D打印的黑盒。放置黑盒可以规避环境光的干扰,确保手机拍照结果准确。黑盒上方开有直径15 mm的小孔,手机摄像头正对圆孔放置,对反应产物进行拍照。检测系统实物照片如图1D所示。黑盒长80 mm,宽60 mm,高180 mm。

图1 微孔条照明器件示意图与LED灯光谱图(A)、微孔条照明器件实物图(B)、基于智能手机检测系统的示意图(C)以及检测系统实物图(D)Fig.1 Schematic diagram of the portable illumination gadget and spectral distribution of the LED(A),photo of the home-made illumination gadget with dimensions(B),schematic diagram of the detection system(C) and photo of the smartphone based detection system with dimensions(D)

2 结果与讨论

2.1 智能手机检测原理与过程

本研究所用自定义手机应用程序(Cardiovascular disease care)界面和检测原理流程图见图2。由图可见,应用程序打开后,首先选择需检测的实验指标,然后选择需上传的图片,最后点击“Next”按钮,图片便自动上传至服务器端(远程计算机)。服务器端再通过基于MATLAB编写的自动分析软件对图片进行比色分析。等待60 s后,服务器会将检测的结果返回手机并显示在应用程序的界面上。

对于服务器端,首先将上传的图片存储进数据库,接着从图片中每个微孔的正中心提取一组15×15的像素阵列,分离出这些像素阵列的红、绿、蓝三色通道。对于酶联免疫吸附试验,提取出蓝色通道的响应值进行后续的比色分析,提取出的蓝色通道响应值在0～255之间。随后,根据预先设定的微孔条位置信息,以第一列为标准样本,剩余三列为未知样本,对像素阵列进行标准样本和未知样本的区分。

对于标准样本,先计算15×15像素阵列下蓝色通道响应的平均值,记为VStd,其中空白孔(去离子水作为样本)的平均响应值记为VStdBlank。再根据公式(1)计算出标准样本在蓝色通道下的实际响应值RStd。

RStd=lg(VStdBlank/VStd)

(1)

根据标准样本在蓝色通道下的实际响应值RStd,利用四参数拟合模型绘制出标准曲线,用于后续对未知样本浓度进行计算。对于未知样本,同理,先计算出15×15像素阵列在蓝色通道响应下平均值,记为VTest。再根据公式(2)计算出未知样本蓝色通道下的实际响应值RTest。

RTest=lg(VStdBlank/VTest)

(2)

其中VStdBlank代表空白孔在蓝色通道下的平均响应值。将RTest代入标准曲线的方程中,反推出未知样本的浓度,记为ConTest。最后将计算结果存储于服务器的数据库,同时将结果发送至手机并显示在应用程序界面上。

图2 自定义智能手机应用程序的屏幕截图和基于图像比色算法的检测流程图Fig.2 Screenshots of the customized smartphone app and the flowchart of the detection principle based on colorimetric algorithm

2.2 颜色通道选择

在酶联免疫吸附试验中,当终止液加入后,溶液颜色由蓝色变为黄绿色。MMP9、ST2和PTX3 3种酶联免疫吸附试验由自定义比色算法提取出的15×15像素阵列见图3A。由图可见,随着质量浓度增加,3种反应溶液的颜色也在相应加深。其中空白孔的颜色为淡蓝色,是因为LED的峰值波长为480 nm,呈现蓝色。然后像素阵列被分成红绿蓝三色通道,每个像素阵列的灰度范围为0～255。3种溶液标准品在红绿蓝三色通道下的平均响应值VStd与浓度的关系见图3B,其蓝色通道表现出很宽的变化范围,覆盖样品的低浓度区间到高浓度区间,随着浓度增加,蓝色通道的平均响应值不断减小。而红色和绿色通道下的平均响应值在整个浓度区间内波动,与浓度无明显相关性。因此,像素阵列在蓝色通道下的响应值是定量计算样本浓度的主要因素。

图3 MMP9、ST2和PTX3反应溶液底部15×15像素阵列(A)以及三者分别在红色、绿色和蓝色通道下的平均响应值(B)和实际响应值(C)Fig.3 15×15 pixel arrays of MMP9,ST2 and PTX3(A),the average RGB values(B) and actual RGB values(C) of MMP9,ST2 and PTX3

为规避溶液本身颜色对实验的影响,根据公式(1)计算出3种溶液的标准样本分别在红绿蓝通道下的实际响应值RStd,其与浓度的关系图见图3C。由图可见,蓝色通道下的实际响应值具有较宽的变化范围,随着浓度的增加,响应值不断增加,并与浓度呈现出一定的递增关系,表明可通过拟合模型进行拟合。而绿色和红色通道的变化范围则较小,随浓度增加变化不大,表明这2种颜色通道在所研究的3种酶联免疫吸附试验中并不敏感。

实验进一步对各颜色通道的敏感性进行验证。基于3种酶联免疫吸附试验分别在红绿蓝三色通道下的实验数据,计算它们的变化范围(响应的最大值与最小值间的差异)和最大不确定度(最大的标准差),并分别记为Range和Uncertaintymax。以变化范围为信号,最大不确定度为噪声,计算每个颜色通道下的信噪比,记为Range/Uncertaintymax,结果见表1。与红色、绿色通道下的实际响应值相比，MMP9、ST2和PTX3 3个试验中蓝色通道下的实际响应值均具有最大的信噪比,分别为54.7832、25.4197和31.9247。而红色和绿色通道的信噪比较低,故对溶液颜色进行分析时采用蓝色通道下的实际响应值进行处理。

2.3 标准曲线分析

通常情况下,酶联免疫吸附试验浓度和响应的关系可以通过四参数拟合模型进行表征[28]。四参数拟合模型如公式(3)所示。

y=P1+(P2-P1)/[1+(x/P3)P4]

(3)

其中,y为样本在蓝色通道下的响应值；x是浓度；P1是曲线的上渐近线估值；P2是下渐近线估值；P3是浓度对应于最小响应与最大响应估计值之间的中间值；P4是曲线的斜率值。

表1 颜色通道分析Table 1 Color channel analysis

图4 MMP9、ST2和PTX3的基于图像比色算法和酶标仪测得数据绘制的标准曲线Fig.4 The standard curves of MMP9,ST2 and PTX3 obtained by the proposed method and the commercial plate reader

MMP9、ST2和PTX3根据图像比色法测得的试验数据绘制出的标准曲线与商用酶标仪检测数据绘制出的标准曲线对比见图4。MMP9、ST2、PTX3标准样本质量浓度范围分别为0.313～20、0.031 3～2、0.313～20 ng/mL。根据标准样本的浓度值和相应蓝色通道下的实际响应值绘制出相应的点坐标,通过四参数拟合模型对数据进行拟合,绘制出标准曲线,得MMP9、ST2和PTX3 3种心肌指标物在蓝色通道下响应值的标准曲线拟合系数(r2)分别为0.999 7、0.999 8和0.999 8,表明线性良好。同理,根据标准样本浓度和商用酶标仪检测出的光吸收度,绘制出相应的标准曲线,得MMP9,ST2和PTX3在酶标仪光吸收度下的r2分别为0.999 5、0.999 3和0.999 6,表明拟合曲线效果良好。对比发现2种方法拟合曲线趋势相近,表明可根据蓝色通道下的标准曲线和未知样本在蓝色通道下的实际响应值推算未知样本的浓度。

2.4 临床样本分析

取实际临床样本，分别在优化条件下应用本检测系统和商用酶标仪进行检测,得MMP9、ST2和PTX3的浓度关系图(图5)。商用酶标仪检测出的指标物质量浓度(x)与自定义手机应用程序检测出的指标物质量浓度(y)呈线性关系,线性回归方程和相关系数如图5A、C、E所示。结果显示,MMP9、ST2和PTX3在临床血清样本质量浓度范围分别为0.10～1.87、0.12～1.84、0.30～7.0 ng/mL,样本个数分别为41、43、40个,通过计算，得2种检测方法的线性相关性分别为99.50%、99.11%和98.93%,表明本方法与商用酶标仪测得数据具有很强的线性相关性。

另一种在临床检测中常用的方法是根据Bland-Altman图(B&A图)分析2种检测方法之间的一致性[29]。误差百分比计算公式为Difference percent=(ConCDC-ConCPR)/[(ConCDC+ConCPR)/2]；式中,ConCDC和ConCPR分别为通过图像比色法和商用酶标仪检出的指标物浓度值。本方法和商用酶标仪测得的MMP9、ST2、PTX3数据绘制的B&A图见图5B、D、F。将2种检测方法所测结果的误差百分比的平均值记为Mean,标准差记为SD。结果显示,MMP9、ST2和PTX3检测结果的平均值分别为1.35%、-3.60%和1.18%,分别有95.12%、97.67%和95.00%的百分比误差点落在平均值加减2倍标准差范围内,相应的范围分别为-7.51%～10.22%、-22.23%～15.03%和-11.89%～14.26%。由此可见,2种方法一致性较好。

3 结 论

本文研制了一套心肌指标物的定量检测系统,可通过手机拍照,利用自定义的比色算法计算未知样本的浓度,并在手机界面显示。将其应用于患者血清样本中MMP9、ST2和PTX3 3种心肌指标物浓度的检测,结果与商用酶标仪具有良好的线性相关性和一致性。该技术可广泛应用于资源匮乏的经济不发达地区,为这些地区的患者提供一种简单快速的心血管疾病诊断方法。

图5 本方法测量指标物浓度和商用酶标仪测得浓度的关系图(A、C、E)和相对误差图(B、D、F)Fig.5 Comparison between the results of biomarkers concentration measured by the proposed method and the reference values obtained by the commercial plate reader(A,C,E) and the percentage difference of the results(B,D,F)