分离式阴极光电化学检测致病菌的新方法研究

杨高霞，董玉明，王光丽

(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)

致病菌的检测对于食品安全、环境保护和公共安全至关重要。在100多种已知的大肠杆菌中，大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)是一种可引起多种食源性疾病爆发的病原体，其感染剂量低至10个活细胞[1]。因此，E.coliO157∶H7的高灵敏度、快速检测备受关注。传统检测E.coliO157∶H7的方法是培养法[2]，但这种方法耗时耗力，不能满足快速检测的要求。非培养方法，如核酸的聚合酶链反应(PCR)具有快速、高灵敏和特异性的优势[3]，但该方法需要昂贵的设备和熟练的技术人员，从而限制了其广泛应用。为了研制出更好方法，最近研究主要集中在电化学[4-7]、荧光[8]等方法的开发；但电化学分析法由于信号的激发及产生均采用同一种能量形式——电能，因而具有较高的背景信号[9]，且在检测致病菌时，往往需要把生物分子固定在电极上[4-7]，导致灵敏度降低，限制了该方法的实际应用。新兴的光电化学(PEC)分析因为具有装置价廉、操作简单并且易于微型化等优点而在多个领域得到了应用[10]，然而新型的PEC分析方法在致病菌检测中的应用未受到关注。

PEC分析法是指基于物质的光电转换特性而确定待测物浓度的一类分析方法，由于激发源(光)和检测信号(电)是两种完全不同的能量形式，因此该方法比传统的电化学法具有更低的背景信号、更高的灵敏度，与光学检测方法相比，PEC分析法所用的仪器更便宜且易于微型化[11]，因此在DNA分析、免疫测定、酶生物传感等领域已被广泛研究与应用[10]。在PEC分析中，相对于研究广泛的以n型半导体构成的光电阳极为换能器的阳极PEC[12]，以p型半导体为光电极的阴极PEC不仅能使电极更加稳定而且对生物实际样品中共存的还原性物质的抗干扰能力更强[13]，在生物分析中具有诱人的应用前景。基于此，本文提出了一种通过形成量子阱(QW)结构以增强阴极光电流的新策略，并将其成功应用于致病菌E.coliO157∶H7的分离式阴极PEC检测。这种分离式阴极PEC检测将生物反应放至微孔板中进行，所产生的信号物质Zn2+与PbSe QDs表面的Pb2+发生离子交换反应后，形成ZnSe/PbSe/ZnSe QW结构，使ITO/PbSe电极的阴极光电流得到极大提高。由于生物分子未固定在电极表面，因此避免了常规PEC分析中，电极表面固定的生物分子由于空间位阻效应阻碍信号分子(通常是溶液中的电子受体/供体)扩散至电极表面产生信号。该方法成功开拓了阴极光电化学在致病菌检测中的应用，有望为开发其它新型高效的PEC检测方法提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硝酸铅、硒粉(Se)、硼氢化钠、巯基乙酸(TGA)、氢氧化钠、硝酸锌(Zn(NO3)2)、硫化钠、甲醇、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS，由4.4 mmol/L Na2HPO4、1.4 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl和137 mmol/L NaCl组成，pH 7.4，25 ℃)；牛血清白蛋白(BSA)；聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA，质量分数为20%的水溶液，平均分子量为200 000～350 000)购自美国 Sigma-Aldrich 公司；(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷(MTPES)、4-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)购自上海麦克林生化科技有限公司；大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7，ATCC 35150)购自美国菌种保藏中心(ATCC)。大肠杆菌DH5α(E.coliDH5α)、沙门氏菌(Salmonella)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、李斯特菌(Listeria)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)获自江南大学生物工程学院。抗菌肽Magainin I的序列是GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS(23 mer)；Magainin I-C是在Magainin I的C末端用半胱氨酸修饰的抗菌肽，其序列是GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKSC(24 mer)，上述两种抗菌肽由南京肽业生物科技有限公司合成并纯化。

用实验室自组装的PEC检测系统进行光电化学(PEC)测量，激发光为500 W 的氙灯(配备紫外线截止滤光片，λ≥400 nm)，CHI 800C电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)获得光电流。检测光电流的三电极系统：PbSe QDs修饰的ITO玻璃电极(深圳南玻显示器件有限公司)为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极作为对电极；所有PEC测试均在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)中进行，电极上的施加电位为-0.05 V(相对于饱和Ag/AgCl)。

1.2 水溶性PbSe QDs的合成及ITO/PbSe电极的制备

巯基乙酸(TGA)修饰的PbSe QDs的制备参照文献[14]稍作修改：在N2气氛下利用超声将3.0 mg Se粉和7.6 mg NaBH4溶解于2.0 mL超纯水中以制备新鲜的NaHSe。将25 mL 4.0 mmol/L Pb(NO3)2水溶液与12 μL TGA在圆底三颈烧瓶中混合后，通过1.0 mol/L NaOH溶液将混合液调至约pH 9.0。N2鼓泡0.5 h以除去反应溶液中溶解的O2后，缓慢注入2.0 mL新制备的NaHSe溶液，反应溶液的颜色由无色逐渐变为深棕色。在N2气氛下将反应混合物再搅拌4 h后，将所制备的PbSe QDs在4 ℃下避光保存。

基于带正电的PDDA和带负电的TGA修饰的PbSe QDs间的静电作用，使用自组装方法在ITO玻璃上修饰PbSe QDs。ITO通过在2.0 mol/L KOH溶液(溶解在异丙醇中)中煮沸20 min后，用水彻底洗涤并在120 ℃下干燥2 h来清洁。将洁净的ITO玻璃依次浸入含有0.5 mol/L NaCl和2%PDDA的水溶液、PbSe QDs溶液中各10 min来制备ITO/PbSe电极，每个浸泡步骤后用超纯水洗涤电极。

1.3 细菌培养与计数

大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)以及其他致病菌株如大肠杆菌DH5α(E.coliDH5α)、沙门氏菌(Salmonella)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的培养均使用Luria -Bertani(LB)培养基，即含10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物的混合物；李斯特菌(Listeria)的培养基为10 g/L胰蛋白胨、3 g/L牛肉提取物和5 g/L NaCl的混合物。所有菌株均在37 ℃下的营养培养基中振荡(125 r/min)孵育,培养完毕，通过离心(6 000 r/min，20 min)分离所有细菌细胞后，用0.01 mol/L过滤后的pH 7.4 PBS缓冲液(由4.4 mmol/L Na2HPO4、1.4 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl和137 mmol / L NaCl组成, 25 ℃)离心洗涤3次，并重新悬浮于0.01 mol/L过滤后的PBS中以除去残留的培养基。

使用平板计数法测定细菌细胞悬浮液的浓度，随后将等分试样的细菌细胞悬浮液用过滤后的PBS稀释至所需浓度，再将细菌细胞悬浮液在沸水浴中加热灭活15 min，最后储存在冰箱中备用。

1.4 实体样的检测

从当地郊区获取的生菜和菠菜(确定施过粪肥)作为待测样品；按照文献处理样品[15]：称取25 g样品，研磨30 min后，加入225 mL 0.01 mol/L灭菌的PBS缓冲液搅拌10 min，混合均匀后，过滤混合物，收集滤液。取适量的该滤液直接用本文开发的分离式PEC法进行检测，以国家标准方法即平板计数法[16]作为参照。

1.5 TGA-ZnS QDs的合成及TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物复合物的制备

为了实现检测，以制备TGA修饰的ZnS QDs(TGA-ZnS QDs)和Magainin I-C的生物复合物(即TGA-ZnS QDs/Magainin I-C)作为信号标记物。首先，按照文献[17]稍作修改后合成水溶性TGA-ZnS QDs，即将50 mL 0.02 mol/L Zn(NO3)2水溶液与250 μL TGA在圆底三颈烧瓶中混合。通过加入1 mol/L NaOH将溶液的pH值调至7.5，使混合液变澄清透明；将该溶液通入氮气0.5 h后加入2 mL 0.25 mol/L Na2S，并将溶液在100 ℃下加热4 h，反应结束后用异丙醇沉淀，离心，用水溶解洗涤，如此反复3次以除去未反应的试剂，烘干。称取40 mg TGA-ZnS QDs溶解于1 mL水中(40 mg/mL)，利用EDC和NHS(ZnS∶EDC∶NHS = 1∶1.5∶1.5的摩尔比)在室温下与TGA-ZnS QDs混合4 h以活化表面羧基，然后离心洗涤除掉过量的EDC和NHS。将88.2 μg Magainin I-C加至活化后的TGA-ZnS QDs溶液中，室温下搅拌12 h，离心洗涤。最后，将TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物复合物再分散于6 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液(pH 7.4)中以供使用。

1.6 分离式PEC检测E.coli O157∶H7

在硅烷化96微孔板之前先用甲醇冲洗96微孔板，然后通过GMBS将Magainin I固定在96微孔板上[18]。具体步骤为：用100 μL的2%硅烷(MPTES)溶液覆盖微孔(将MPTES溶解在用1.0 mol/L乙酸调至pH 4.0的甲醇中)并温育30 min，随后去除溶液并用甲醇洗涤，氮气干燥；然后取100 μL 1.0 mmol/L GMBS的无水乙醇溶液加入微孔板，孵育30 min后去掉溶液并洗涤；随后向孔中加入100 μL 250 μg/mL Magainin I溶液(以10 mmol/L的PBS缓冲溶液作为溶剂)，在室温下振荡孵育2 h；然后加入100 μL的1%BSA封闭液封闭30 min，洗涤；再加入100 μL不同浓度的E.coliO157∶H7并在室温下孵育30 min，洗涤；随后加入TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物复合物，孵育30 min，洗涤。加入60 μL 0.1 mol/L HNO3溶解TGA-ZnS QDs后，再加入60 μL 0.1 mol/L NaOH将溶液调至pH 7.0。最后，将ITO/PbSe电极浸入含有上述溶液的96微孔板中15 min。取出电极，用0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)洗涤，并在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)中进行PEC测量。

2 结果与讨论

2.1 PbSe QDs的表征

采用X射线衍射法(XRD)以及透射电镜法(TEM)对合成的PbSe QDs的组成和形貌进行表征。PbSe QDs的XRD图谱在25.15°、29.12°、41.65°、49.28°、51.63°、60.37°、68.41°、76.02°处出现尖锐的衍射峰(图1A)，对应晶面分别为(111)、(200)、(220)、(311)、(222)、(400)、(420)和(422)，与岩盐晶体结构的PbSe(JCPDS 06-0354)一致。TEM图表明所合成的PbSe QDs为球形粒子，直径约为3.0 nm(图1B)。

2.2 Zn2+增大ITO/PbSe电极阴极光电流的机理

ITO/PbSe电极在可见光照射下显示出阴极光电流，在重复光激发循环照射下，光电流无明显降低，表明该电极具有良好的光照稳定性(图1C)。PbSe QDs的光电流产生机理如下：当能量等于或大于其带隙能量的光子激发PbSe QDs时，分别在导带(CB)和价带(VB)上形成电子和空穴。光生电子从PbSe的CB转移至溶液中的电子受体，光生空穴被ITO电极上的电子捕获，产生阴极光电流。在Zn2+存在下，ITO/PbSe电极的光电流显著增强(图1D)。这是由于Zn2+的离子半径小于Pb2+，即ZnSe的晶格能高于PbSe的晶格能，因此Zn2+能和PbSe中的Pb2+发生阳离子交换反应形成ZnSe[19]。采用X射线光电子能谱(XPS)对通过Zn2+处理前后的ITO/PbSe电极进行全扫描(图2A)，通过Zn2+处理ITO/PbSe电极后可观察到明显的Zn 2p峰，表明PbSe QDs表面形成了ZnSe。分别对Pb 4f，Zn 2p和Se 3d进行高分辨率XPS光谱分析(图2B-D)，其中B图在137.3 eV和142.4 eV处的结合能分别为Pb 4f7/2和Pb 4f5/2的自旋轨道，C图在1 025.14 eV的结合能归属于Zn 2p3/2自旋轨道，而D图的52.98 eV和53.8 eV的结合能则分别为Se 3d5/2和Se 3d3/2自旋轨道。根据价带和导带的带隙位置，表明PbSe QDs表面沉积ZnSe后，形成了ZnSe/PbSe/ZnSe量子阱(QW)结构，由于这种结构界面处(即PbSe/ZnSe界面)的晶格错配产生压电极化电荷，这些极化电荷导致在PbSe层形成三角形势阱。正/负压电电荷在左/右侧累积，从而在QW中引起能带的线性倾斜，然后电子和空穴的波函数在倾斜带中以相反的方向分离，将波函数重叠减小到较低的辐射复合率[20-21]，从而产生更多的光生载流子，使阴极光电流得到极大提高。

图1 PbSe QDs的XRD(A)及TEM图(B)，ITO/PbSe电极的光稳定性测试(灰色区域为光照条件下，C)，及0.1 mmol/L Zn2+存在下ITO/PbSe电极的光电流响应(D)Fig.1 XRD(A)and SEM(B)images of PbSe QDs,the operational stability test of ITO/PbSe electrode(the grey area are on illumination,C),and photocurrent response of ITO/PbSe QDs electrode in the presence of 0.1 mmol/L Zn2+(D)

2.3 分离式检测原理

根据Zn2+可以增强ITO/PbSe电极的阴极光电流这一现象，本文设计了分离式阴极PEC检测E.coliO157∶H7的方法。其检测原理如图3所示：选择抗菌肽Magainin I和Magainin I-C来识别E.coliO157∶H7[22]。这是由于相比较于抗体，抗菌肽具有在恶劣环境条件下依然保持活性，不会使细菌产生抗性，以及低浓度下也能起识别作用等优点[23]。首先，通过GMBS将Magainin I固定在微孔板上以识别E.coliO157∶H7，再引入TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物复合物(选TGA-ZnS QDs作为示踪剂是因为其易于合成且可被HNO3溶解产生Zn2+)使其结合E.coliO157∶H7。通过TGA-ZnS QDs产生Zn2+与ITO/PbSe电极表面上的Pb2+交换，增强阴极光电流。通过UV-Vis吸收光谱法可观察到TGA-ZnS和Magainin I-C的特征吸收峰，证实了TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物复合物的成功合成(图4)。

图2 ITO/PbSe电极及其用0.1 mmol/L Zn2+处理后的全扫描XPS光谱(A)；Pb 4f(B)，Zn 2p(C)及Se 3d(D)的高分辨率XPS光谱Fig.2 Full-scan XPS spectra of ITO/PbSe QDs before and after reacting with 0.1 mmol/L Zn2+(A),high-resolution XPS spectra of Pb 4f(B),Zn 2p(C)and Se 3d(D)

图3 E.coli O157∶H7的分离式PEC生物测定示意图(A)，Zn2+与PbSe QDs中Pb2+的交换示意图(B)，及与Zn2+反应后ITO/PbSe电极信号的产生机理(C)Fig.3 Schematic diagram of the split-type PEC bioassay for E.coli O157∶H7(A),diagrammatic sketch of Zn2+exchange with Pb2+of PbSe QDs(B),and the signal generation mechanism of ITO/PbSe electrode after treated with Zn2+(C)

2.4 实验条件的优化

为了实现对E.coliO157∶H7的最佳检测，本文优化了生物反应的实验参数，通过研究发现E.coliO157∶H7和Magainin I的孵育溶液pH值和孵育时间对检测结果影响较大。首先对孵育溶液的pH从偏酸性开始考察，随着pH值的提高，体系的光电流增强，当pH值7.4时体系的光电流强度最大，随着pH值的继续增大，光电流反而减弱,因此本实验选择孵育溶液的最佳pH值为7.4(图5)。此外，随着孵育时间的增加，检测体系的光电流也在增强，当孵育30 min后，检测体系的光电流不再随时间的延长而增强，表明体系已达到饱和状态，因此实验选择30 min为最佳孵育时间。

图5 pH值的影响Fig.5 Effect of pH value

图4 TGA-ZnS QDs(a)、Magainin I-C(b)及TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物复合物(c)的UV-Vis吸收光谱Fig.4 UV-Vis absorption spectra of TGA-ZnS QDs(a),Magainin I-C(b) and TGA-ZnS QDs/Magainin I-C bioconjugates(c)

2.5 E.coli O157∶H7的PEC分析及与其他检测方法的比较

在最优实验条件下，体系的光电流强度(ΔI)随着E.coliO157∶H7浓度(C,CFU/mL)的升高而升高，在10.0～5.0×106CFU/mL范围内呈线性增强，线性方程为ΔI=0.37logC-0.38，检出限(LOD，S/N=3)为4.0 CFU/mL。表1对本方法及其它检测E.coliO157∶H7的方法进行比较，如电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[24]、免疫色谱法(ICA)[25]、电化学发光法(ECL)[26]及电化学法(EC)[5-7,27]。可以看出，本文所开发的分离式PEC检测法在灵敏度和线性范围方面具有明显优势。

图6 E.coli O157∶H7(5.0×105 CFU/mL)与其它干扰物(1.0×106 CFU/mL)的响应Fig.6 Response for E.coli O157∶H7(5.0×105 CFU/mL)and other interferents(1.0×106 CFU/mL)

2.6 干扰菌的影响

除检测目标致病菌E.coliO157∶H7外，PEC传感器还用于检测非致病性大肠杆菌DH5α(E.coliDH5α)、沙门氏菌(Salmonella)以及铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、李斯特菌(Listeria)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)4种革兰氏阳性菌以评估该方法的选择性(图6)。结果显示，除沙门氏菌外，其他几种物质均未产生明显的光电流变化。这是由于Magainin I与Magainin I-C仅特异性结合带有O-抗原侧链脂多糖(LPS)的细胞膜[28-29]。本文的工作可用于区分致病性大肠杆菌和非致病性大肠杆菌以及革兰氏阴性与阳性菌，意味着基于抗菌肽的传感器具有检测革兰氏阴性细菌的潜力。但本传感器不能区分革兰氏阴性致病菌大肠杆菌与沙门氏菌，其主要原因是两者细胞膜具有相似的结构，这与文献结果一致[30]；由于E.coliO157∶H7一般污染施过粪肥的农产品[31]，而肉类产品一般在运输或牲畜屠宰过程中受沙门氏菌污染[32]。因此，本文开发的传感器虽不能区分这两种菌，但可以应用于实际样品的检测。

表1 不同检测E.coli O157∶H7方法的比较Table 1 Comparison with different methods for detection of E.coli O157∶H7

(续表1)

MethodMaterialLinearrange(CFU/mL)LOD(CFU/mL)ReferenceECLRucomplex5.0×102～5.0×1051.3×102[26]ECPPy/AuNP/MWCNT30.0～3.0×10730.0[5]ECrGO-NR-Au@Pt4.0×102～4.0×1084.5×102[6]ECFc1.0×103～1.0×1081.0×103[7]ECrGOPE1.5×102～1.5×1071.5×102[27]PECPbSeQDs10.0～5.0×1064.0Thiswork

*：no data

2.7 实体样的检测

为了评估该PEC传感器用于实际样品检测的可行性，分别检测了生菜和菠菜滤液中E.coliO157∶H7的含量，结果见表2。检测结果与检测微生物的标准法(平板计数法)检测结果进行比较，计算出t值小于t0.1,4(2.13)，表明本方法与标准方法具有良好的一致性。

通过标准加入法在自来水和胡萝卜汁(购自超市)中分别添加1.00×102、1.00×104和1.00×106CFU/mL 3种浓度(平板计数法读出)的灭活E.coliO157∶H7，以计算本方法的加标回收率。结果显示，本方法未在自来水或胡萝卜汁中检出E.coliO157∶H7，说明本实验所用的自来水和胡萝卜汁中的E.coliO157∶H7含量未在检测范围内，均符合卫生标准。测得本方法的回收率为94.7%～104%，相对标准偏差(RSD)为1.9%～2.8%。表明本文建立的抗菌肽的分离式PEC策略在实际应用中具有较好的效果(表3)。

表2 生菜和菠菜中E.coli O157∶H7含量的检测Table 2 Detection of E.coli O157∶H7 content in lettuce and spinach (n=5)

*was figured by means of at-test statistical analysis between two methods

表3 自来水和胡萝卜汁中E.coli O157∶H7的加标回收率Table 3 Spiked recoveries of E.coli O157∶H7 in tap water and carrot juice (n=5)

* no detected

3 结 论

本研究发现通过在PbSe QDs表面形成ZnSe并构成ZnSe/PbSe/ZnSe 量子阱(QW)结构，能明显提高PbSe的阴极光电流。这是量子阱结构在PEC研究中的新应用。基于此，开发了一种分离式阴极PEC检测E.coliO157∶H7的新方法，E.coliO157∶H7的检测范围为10.0～5.0×106CFU/mL，检出限为4.0 CFU/mL。与标准方法相比，本PEC分析法无需进一步孵育、方便快速，有望为食品安全、环境卫生等领域监测E.coliO157∶H7提供一种快速高效的途径。