有氧联合抗阻训练激活激素敏感性脂肪酶与交感神经途径显著减少脂肪积累

2019-08-21刘阳张赛何玉秀李朋

中国运动医学杂志 2019年7期

刘阳张赛何玉秀李朋

1 河北师范大学体育学院人体运动生物信息测评省重点实验室（石家庄050021）

2 河北师范大学体育学博士后科研流动站（石家庄050021）

肥胖严重威胁人类健康。过多的脂肪，尤其是腹部内脏脂肪积累，是心血管及代谢类疾病的独立危险因素[1]。有氧耐力训练（aerobic endurance training，AT）和抗阻训练（resistance training，RT）是运动减肥最常用的训练方式。然而大量临床证据显示，单纯进行抗阻训练并无减肥效果[2]，而单纯进行有氧训练时，减肥效果不如联合使用有氧与抗阻训练时明显[3-5]。目前，美国运动医学会、美国心脏病协会和美国糖尿病协会都推荐有氧联合抗阻训练（combination of aerobic and resistance training，ART）为最佳的减肥与代谢性疾病改善运动处方[6-7]。ART可更有效地减少内脏与皮下脂肪积累，同时也能够更显著地改善糖脂代谢[8]，已有研究者从炎症、Adropin激素和脑源性神经营养因子等角度对其减肥效果更明显的内在机制进行了初步探讨[9-11]。但ART对脂肪组织分解途径的直接作用如何，由何种信号进行调节，很少见到相关报道。

有氧训练由于运动持续时间长，在运动中能消耗较多能量。而抗阻训练的间歇较多，总时间内的平均代谢当量只有3～4 Mets[12]。所以当训练时间相同时，ART较单纯有氧训练消耗的能量更少。抗阻训练较有氧训练对机体的神经、内分泌和免疫功能的刺激更剧烈[13]。研究显示，即使在对外做功相同时，不同的训练强度由于对机体的刺激不同，也会产生不同的减肥效果[14]。由于ART 使用了有氧与抗阻训练，可在消耗较多能量的同时对机体带来较大的刺激，可能会更明显地激活神经、免疫、内分泌和肌肉因子等促脂解途径，进而促进脂肪分解。

机体分泌的儿茶酚胺、生长激素等脂解类激素在强烈刺激下可激活激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL），促进脂肪水解。骨骼肌分泌的鸢尾素（irisin）则能在运动后通过提高脂肪细胞合成解耦联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP-1）的表达促进脂肪氧化产热。2017年新发现，脂肪组织炎症状态的改变，能驱动巨噬细胞分泌儿茶酚胺进而促进脂解[15]，而交感神经同样可通过儿茶酚胺类神经递质促进脂解[16]。本研究选取以上途径作为ART 可能激活的靶点，给予肥胖小鼠总时间相同的单纯有氧训练和有氧联合抗阻训练。在对比两种训练减肥效果的同时，观察不同训练方法对水解酶HSL、氧化蛋白UCP-1、交感神经特异性标志物酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、炎症因子白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）的激活差异，探讨ART究竟通过何种内在机制达到了更显著的减肥效果，为科学制定运动处方提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组与肥胖动物模型的建立

3 周龄雌性C57bl/6 小鼠（购自北京维通利华实验动物公司）随机分为普通膳食组（C组，10只）与高脂膳食建模组（H组，100只），自由饮水、摄食。C组给予标准饲料，H 组给予高脂饲料（60%标准饲料+16%白砂糖+5%猪油+18%蛋黄粉+1%胆酸钠）。15 周后，从H组中体重大于C组平均体重10%以上的个体中随机选取18只作为肥胖模型，随机分为高脂膳食对照组（HFD组）、单纯有氧训练组（AT 组）和有氧联合抗阻训练组（ART 组），每组各6只。AT 与ART 组在高脂饲养的同时进行12 周训练，HFD 组在此期间只进行高脂饲养、不训练。实验动物单笼饲养，并在建模及训练全程的每周最后一天，称量个体体重及饲料消耗。

1.2 实验动物训练方案

肥胖模型建立后，分别对AT和ART组进行总时间相同的单纯有氧训练和有氧联合抗阻训练干预，每周5次，共12 周。AT 组每次在25°上坡跑台上训练45 min，初始跑速13 m/min，并在第5周逐步提高至17 m/min，维持至12 周结束。依据Høydal 对发育中小鼠运动能力变化的研究，此强度始终约为60%最大摄氧量[17]。ART 组进行36 min 相同强度的跑台训练，结束后立即再进行9 min抗阻爬梯训练。梯宽0.2 m，有效高度1.0 m，85°斜置。初始负荷为10%体重，并在3 周内递增至150%。每次完成2组训练，每组包含3次爬梯，单次爬梯时间约20～30 s，每次间隔1 min，组间间隔2 min，保证小鼠在9 min 内完成全部6 次爬梯。由于抗阻爬梯训练实际运动时间只有约2～3 min，间歇时间较长，约6～7 min，能量消耗的绝对值并不高。有研究显示，相同时间内中等强度的抗阻训练，代谢当量约3～4 METs[12]，只相当于较低强度的有氧运动。故本研究的小鼠在完成一次训练时，ART 组运动中的能量消耗应与AT组相当或略低。

1.3 动物取材与称重

在12 周的末次训练结束后48 小时取材。待小鼠排尿排便后测量体重。0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，摘眼球取血并分离血清。打开胸腹腔，生理盐水由右心耳进行动脉灌流。仔细剥离完整的子宫周围脂肪（代表内脏脂肪）和腹股沟皮下脂肪（代表皮下脂肪）并称取重量。剥离双腿腓肠肌，保留合适大小的肌腹部分。血清、脂肪和肌肉组织分装后-80°冻存。

1.4 血脂四项测试

采用比色法测试血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）四项血液指标。试剂盒购自南京建成，货号TG：A110-2，TC：A111-2，LDL-C：A112-2，HDLC：A113-2，严格按照说明书操作。

1.5 组织蛋白表达和磷酸化水平测试

采用蛋白质免疫印迹（Western blot）法测试肌肉组织过氧化物增殖物活化受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）、纤维连结蛋白Ⅲ型域包含蛋白5（FNDC5），脂肪组织UCP-1、TH、白细胞介素6（IL-6）、HSL 总蛋白及ser563、ser660 磷酸化表达。RIPA 对匀浆后组织进行裂解，离心取上清，BCA 试剂盒（购自Solarbio）测试总蛋白浓度，并依据浓度向样品内加入适量Loading Buffer，煮沸后冻存备用。SDS-PAGE 体系电泳选用4%浓缩胶，12%分离胶，每孔上样30 μg。电泳完成后将目的条带湿转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育2 小时后发光。ImageJ 1.51 计算灰度值。PGC-1α、FNDC5、UCP-1、TH、一抗购自Abcam；HSL 及HSL-ser563、HSL-ser660一抗购自CST，IL-6一抗购自GeneTex。

1.6 统计学方法

数据使用平均数±标准差（）表示。由于动物饲养时自由摄食，不同个体的进食量差异可能对体重、不同部位脂肪重量产生影响，故采用协方差分析，将摄食量作为协变量以消除其对结局变量的干扰，分析不同训练方案运动后体重与脂肪重量的差异。不同组间摄食量、血脂四项和组织蛋白表达指标采用单因素方差分析，采用LSD 法进行两两比较。统计软件为SPSS 24.0，取P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种训练方式的减肥效果

以总摄食量作为协变量，对12周训练后减肥效果进行协方差分析，发现摄食量对腹股沟皮下脂肪（代表皮下脂肪）重量具有显著的影响（P＜0.01），对体重、子宫周围脂肪（代表内脏脂肪）重量无显著影响。去除摄食量干扰后，ART组体重、子宫周围和腹股沟皮下脂肪均低于HFD组（P＜0.05或P＜0.01），且ART 组子宫周围和腹股沟皮下脂肪也显著低于AT 组（P＜0.05 或P＜0.01）；单因素方差分析显示三组摄食量无显著差异。见图1。

图1 各组小鼠体重、脂肪重量与摄食量比较（n=6）

2.2 两种训练方式对血脂四项的影响

图2 各组小鼠血脂四项比较（n=6）

对血脂四项进行单因素方法分析显示，三组间TG、TC和HDL-C无显著差异；ART组LDL-C显著低于HFD 组（P＜0.05），有低于AT 组的趋势但不显著（P=0.130），AT组与HFD组无差异。见图2。

2.3 脂肪水解酶HSL蛋白表达与磷酸化水平

训练后各组HSL 总蛋白表达均无显著差异。AT组和ART 组皮下脂肪HSL-ser563 磷酸化表达均低于HFD 组（P＜0.05）。无论皮下或内脏脂肪，AT 组与ART组HSL-ser660 磷酸化表达均高于HFD 组（P＜0.05 或P＜0.01），ART 组皮下脂肪ser660 磷酸化表达高于AT组（P＜0.05），但内脏脂肪AT 组与ART 组间无显著差异。见图3。

图3 各组小鼠脂肪水解酶HSL蛋白表达与磷酸化水平（n=6）

2.4 脂肪氧化蛋白UCP-1 及上游调节信号骨骼肌PGC-1α与FNDC5的变化

12 周训练后，腓肠肌PGC-1α表达三组间无显著差异；FNDC5 表达三组间存在差异的趋势（P=0.107），两两比较显示ART 组有高于AT 组与HFD 组的趋势（P=0.096与P=0.050），但无统计学意义。AT组与ART组皮下脂肪UCP-1 表达量均高于HFD 组（P＜0.05），但两组间差异无统计学意义。见图4。

图4 各组小鼠脂肪氧化蛋白UCP-1及上游调节信号变化（n=6）

2.5 脂肪组织交感神经标志物TH 及炎症因子IL-6 变化

12 周训练后，皮下脂肪TH 表达三组间无显著差异；内脏脂肪TH 三组间存在显著差异（P＜0.05），AT 组显著低于HFD 组与ART 组（P＜0.05）；IL-6 表达各组均无显著差异。

图5 各组小鼠脂肪组织交感神经标志物TH及炎症因子IL-6变化（n=6）

3 讨论

3.1 ART 减少脂肪积累与改善血脂的效果优于单纯有氧训练

传统观点认为，中等强度有氧运动的脂肪供能比例较高，且持续时间长，是最为有效的减肥运动方式。但此观点并未考虑运动后神经体液调节下脂肪的进一步代谢。如前言所述，大量研究证明ART 的减肥效果优于单纯有氧训练。此外ART 在提高心血管机能、缓解胰岛素抵抗、改善心理状态等方面也优于单纯有氧训练[18-21]。本研究采用运动时间相同的两种训练方法对小鼠进行12周运动干预，发现ART在降低内脏与皮下脂肪积累方面，均显著优于单纯有氧训练。Park 的人体研究结果与本研究类似，他对肥胖中年女性分别进行每周6 天的有氧训练或每周3 天有氧训练加3 天抗阻训练，发现ART 能够更有效地降低内脏与皮下脂肪重量[22]。但也存在一些不同的结果，Dâmaso 对肥胖青少年进行运动干预后发现，ART 减少内脏脂肪的效果优于单纯有氧训练，而对皮下脂肪两种训练效果无差异[23]。Alberga 的研究中，ART 与单纯有氧训练在减少皮下脂肪上具有相同的效果，但对内脏脂肪无作用[24]。各个研究中不同位置脂肪的变化并不一致，提示虽然ART在促进脂肪分解方面较单纯有氧训练具备优势，但具体的效果与运动方案的设计及受试者的差异有关。本研究结果也显示，虽然ART 组小鼠脂肪重量低于AT 组，但两组体重并无差异，这可能是ART 在促进脂肪分解的同时，提高了瘦体重造成的。相关研究与此假说类似，Villareal的研究证实ART能更明显地提高瘦体重[25]。

已有研究表明，无论是单纯有氧、抗阻或联合训练，都具有改善血脂的效果，但ART 提高HDL/LDL 比值的作用更明显[24]。Mann在一篇系统综述中总结了有氧、抗阻和联合训练对血脂的作用，指出HDL与运动量呈线性关系，而LDL、TG则与运动强度密切相关[26]。此观点解释了本研究的结果：由于AT与ART的运动量相似，但ART 对机体的刺激更剧烈，故而出现ART 组LDL-C显著低于AT组，但两组间HDL-C无显著性差异。

本研究中，各组动物的摄食量与不同部位脂肪IL-6 含量均无显著差异，说明无论单纯有氧或者ART 训练，都不能对能量摄入和安静时脂肪的炎症状态产生明显影响。

3.2 ART 通过HSL促进皮下脂肪水解的效果高于单纯有氧训练

研究显示，由于抗阻训练运动间隔时间较长，能量消耗只相当于3～4 METs的低强度有氧训练[12]。本研究的跑台训练相当于约60%最大摄氧量，故而ART 组小鼠在完成36 min跑台训练和9 min抗阻爬梯训练所消耗的能量，应略低于AT组45 min跑台训练的能量消耗。结果显示ART 虽然未消耗更多能量，但能使脂肪积累减少。同时，ART组与AT组的摄食量也无显著差异，说明ART也未显著减少能量摄入。这说明，ART的减脂效果，与运动中脂肪消耗或能量摄入改变无关，脂肪积累的降低很可能与运动后脂肪的分解与氧化相关。

脂肪组织内甘油三酯的分解，分为水解和氧化两个阶段。在水解阶段，甘油三酯首先被脂肪甘油三脂水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）和HSL 水解为游离脂肪酸和甘油二酯，之后再被HSL 水解为游离脂肪酸和甘油一酯，最后被单酰甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MAGL）水解为甘油和游离脂肪酸，ATGL和HSL是在整个水解过程的关键限速酶。ATGL活性由比较基因识别物-58（comparative gene identification-58，CGI-58）与其的结合调节。虽然有研究表明，长期运动时ATGL 的表达增加，且与CGI-58 的结合也上升[27]，但更多研究显示脂肪组织ATGL的激活并非由运动直接引发，而是与机体能量代谢有关。Nielsen 发现，运动不能直接激活ATGL，禁食却能显著升高ATGL mRNA 表达量[28]。Gaidhu 发现高脂膳食诱导的肥胖大鼠，ATGL不降反升[29]。John发现，ATGL脂肪组织特异性基因敲除小鼠的耐力性运动能力伴随着脂肪代谢水平降低出现了显著下降[30]。这些研究提示，运动对ATGL 的影响主要是通过影响能量供应来间接调节的，肥胖小鼠ATGL的激活与脂肪重量的下降并无直接关系。HSL活性的升高与脂解类激素（儿茶酚胺、生长激素、心钠钛等）激活cAMP-PKA 信号途径，进而增加ser563和ser660磷酸化有关，“能量开关”AMPK可通过磷酸化ser565来抑制HSL活性。虽然ART与单纯有氧训练的能量消耗相似，但它对机体的刺激更大，可促进更多的激素分泌。因此，本研究选择了HSL而非ATGL作为ART 促脂肪水解的靶点，假设ART 可诱发机体产生更多的脂解类激素，提高HSL磷酸化水平，促进脂肪水解。

本研究的结果显示，AT 与ART 组皮下脂肪ser563较基线值均显著下降，但内脏与皮下ser660 都显著上升。Ser563没有与ser660同步上升，可能与AMPK的抑制有关。研究显示，AMPK 对ser563 的抑制作用强于ser660，但ser660 与HSL的水解活性关系更高[31]。AMPK 是细胞内的能量开关，而有氧训练对细胞内的能量代谢有着强烈的影响。AT 与ART 的有氧训练部分可通过激活AMPK 进而抑制ser563 磷酸化，但由于AMPK 对ser660 的抑制较弱，故出现了两个训练组ser563降低，但ser660升高，HSL被激活的现象。同时应注意到，ART 组皮下脂肪HSL-ser660 不但高于基线值，也显著高于AT 组，说明联合训练可更有效促进皮下脂肪水解。此结果揭示了ART减少皮下脂肪积累的效果优于单纯有氧训练的一个重要机制。

3.3 ART与单纯有氧训练通过UCP-1促进皮下脂肪氧化分解的效果相同

脂肪水解产生的游离脂肪酸，除通过血液运输至全身外，还可在脂肪细胞内借助UCP-1 被直接氧化。UCP-1 存在于线粒体内膜上，可通过解耦联电子传递系统阻止ATP 生成，使脂肪酸的化学能直接转化为热量，参与非颤栗性产热。研究发现，骨骼肌在运动后可向血液分泌肌肉因子鸢尾素（Irisin），其到达脂肪细胞后可使UCP-1 高表达，促进脂肪氧化[32]。运动可激活肌细胞PGC-1α，继而促进纤维连结蛋白Ⅲ型域包含蛋白5（fibronectin type Ⅲdomain-containing protein 5，FNDC5）表达，FNDC5经过剪切修饰后会变为Irisin，并由肌细胞向循环血液分泌。ART 相对于单纯有氧运动，对骨骼肌的刺激更剧烈，所以本研究假设ART可更强烈地激活骨骼肌PGC-1α—FNDC5—Irisin 途径，通过UCP-1促进脂肪氧化。但由于Irisin是血液激素，除受FNDC5合成量的控制外，还受血浆容量和机体代谢的影响，Irisin 与FNDC5 的变化并不同步[33]。在某些运动干预中，Irisin 浓度不升反降[34]。所以本研究用FNDC5 作为反映ART 通过肌肉因子促UCP-1 合成的指标。

急性运动可显著提高骨骼肌PGC-1α，但本研究三组PGC-1α无差异，说明运动后48小时PGC-1α已经回落至基线状态。ART组FNDC5相对于HFD组和AT组都有升高的趋势（P=0.05 和P=0.09），提示ART 可能会通过对肌肉的刺激促进FNDC5合成。限于实验规模，本研究没有进行多时间点肌肉采样，FNDC5 在运动后48小时也已经回落，故而其虽有升高趋势但不具显著性。

本研究AT 与ART 组皮下脂肪UCP-1 表达均显著升高，但内脏脂肪无变化，这与前人的研究相符。Boström发现，运动提高皮下脂肪UCP-1表达的效果比内脏脂肪明显[32]，提示运动促脂肪氧化的效果，对皮下脂肪更明显。但是本研究并未发现ART 组皮下脂肪UCP-1 表达高于AT 组，说明ART 虽有促FNDC5 合成的趋势，但不能显著提高皮下脂肪氧化产热。

3.4 单纯有氧训练抑制内脏脂肪交感神经活动，ART可解除此种抑制

本研究假设ART 能够对机体的神经、内分泌系统和肌肉产生更高的刺激。当内分泌系统受刺激被激活时，会产生更多脂解类激素激活HSL水解；肌肉被激活时则通过Irisin 促脂肪UCP-1 表达与氧化。虽然结果支持ART 能更显著地激活皮下脂肪HSL，但ART 组内脏脂肪HSL和UCP-1表达与AT组无显著差异，此结果不支持ART通过内分泌及肌肉因子分泌途径促进内脏脂肪分解的假设。此结果提示ART更显著减少内脏脂肪的训练效果，可能与神经调节有关。

研究显示，交感神经的活动与减少内脏脂肪密切相关。Stefanie 发现，交感神经活跃度与内脏脂肪重量的相关性高于全身脂肪和皮下脂肪重量[35]。Sipe 发现节食小鼠内脏脂肪的减少，会伴随交感神经兴奋，药物阻断交感神经后，节食减少内脏脂肪的作用也随之降低[36]。支配脂肪的交感神经可通过多种途径促进脂肪分解，如Zeng 的研究证实交感神经可通过激活HSL 促进脂肪水解[37]，Fischer 和Jiang 的研究也发现交感神经能通过UCP-1 促进脂肪氧化[16，38]。本研究观察了交感神经活动的特异性标志物TH在脂肪组织中的表达，发现AT组内脏脂肪TH表达显著低于HFD组和ART组，这说明ART 减少内脏脂肪的效果较好，此效果与交感神经活动关系密切。ART与单纯有氧训练对脂肪交感神经的激活作用，值得深入比较研究。需注意的是，ART组HSL和UCP-1表达与AT组相同，交感神经是否通过其他途径促进内脏脂肪分解，有待进一步探索。