3种龙胆草粗提物的抑菌活性及稳定性

2019-08-20廖雯孙爱群刘新颖卢虹

江苏农业科学 2019年8期

廖雯　孙爱群　刘新颖　卢虹

摘要：以从贵州省六盘水市采集的头花龙胆（Gentiana cephalantha）、红花龙胆（G. rhodantha）及于毕节市采集的翼萼龙胆（G. pterocalyx）为材料，用超声、浸提及回流法提取粗提物，采用滤纸片扩散法，以抑菌圈大小为评价指标，检测3种龙胆草粗提物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌的抑菌活性，考察氧化剂、温度、pH值及紫外线对龍胆草粗提物抑菌活性的影响。结果表明，头花龙胆与翼萼龙胆用3种提取方法所得粗取物的抑菌效果大致相当，而红花龙胆用超声与浸提法所得提取物的抑菌效果大致相当，回流法所得提取物的抑菌效果稍弱。头花龙胆浸提液对大肠杆菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）均为0.100 g/mL，红花龙胆浸提液对以上3种菌的MIC分别为0.050、0.100、0.050 g/mL，翼萼龙胆浸提液对以上3种菌的MIC分别为0.150、0.100、0.150 g/mL。由结果可以看出，氧化剂能够增强3种龙胆草的抑菌活性;3种龙胆草提取物具有热稳定性;酸性环境的抑菌活性大于碱性环境，当pH值为4时，抑菌效果最好;在紫外线照射下，抑菌活性变化不大。综合对3种细菌的抑菌效果可知，研究所用的3种龙胆可以被开发成天然的抑菌剂。

关键词：红花龙胆草;翼萼龙胆草;头花龙胆草;大肠杆菌;金黄色葡萄球菌;铜绿假单胞菌;最低抑菌浓度

中图分类号： R285.5文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）08-0198-04

龙胆属（Gentiana）植物在我国有247种[1]，在贵州省有29种1个变种，其中在贵州六盘水有13种[2-3]。头花龙胆（G. cephalantha）具有泻肝火、清下焦、除湿热的功效[4]。红花龙胆（G. rhodantha）为《中华人民共和国药典》2015版中新收载的品种，具有清热除湿、解毒、止咳的功效[5]。目前尚未见翼萼龙胆（G. pterocalyx）入药的报道。龙胆属植物大多含有龙胆苦苷，徐竺婷等认为，龙胆苦苷对口腔内的多种细菌具有抑制作用[6];贺平等认为，以白花龙胆为主成分的龙胆花丸对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，最低抑菌浓度（MIC）为 6.25～12.5 mg/mL[7];蓝玉簪龙胆（G. veitchiorum）对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用[8];滇龙胆（G. rigescens）对21株试验细菌有抗菌作用，对10株致龋菌的MIC大于 20 mg/mL[9];以龙胆（G. scabra）等10味中草药组成的泻痢停制剂对沙门氏菌、大肠杆菌有较好的抑制作用[10];从云雾龙胆（G. nubigena）中分离的内生菌对苹果腐烂病病菌的生长有显著的拮抗作用[11]。目前尚未见关于头花龙胆、红花龙胆及翼萼龙胆的抑菌作用及稳定性的报道。本试验以头花龙胆、翼萼龙胆和红花龙胆为材料，比较不同方法提取的粗提物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌的抑菌效果及抑菌稳定性，旨在为开发天然抑菌剂提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料及供试菌种

试验材料为头花龙胆（采自贵州省六盘水市钟山区韭菜坪，海拔 2 600 m）、红花龙胆（采自贵州省六盘水市水城县俄脚村，海拔1 750 m）、翼萼龙胆（采自贵州省毕节市威宁县艾家坪村，海拔2 300 m）。将3种龙胆洗净，干燥至恒质量，粉碎，备用。

供试菌种大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由六盘水师范学院生物科学与技术学院微生物学实验室提供。试验于2017年2—5月在六盘水师范学院微生物实验室进行。

1.2仪器与试剂

SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;HH-601恒温水浴锅，金坛市恒丰仪器厂;303A-2型数显电热培养箱，上海跃进医疗器械有限公司;MLS-3750高压灭菌锅，日本三洋电器股份有限公司;DFT-200手提式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司;SHB-3 循环水多用真空泵，郑州杜甫仪器厂。

主要试剂：NaOH、HCL、NaCl、95%乙醇，均为分析纯;牛肉膏，北京双旋微生物培养基制品厂;蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司;纯化琼脂，杭州微生物试剂有限公司;青霉素，中诺药业（石家庄）有限公司。

1.3试验方法

1.3.1粗提液的制备称取头花龙胆、红花龙胆及翼萼龙胆全草，分别用超声、浸提及索式回流方法提取。经过预试验筛选出的提取条件如下：3种方法所用提取溶剂为70%乙醇，料液比为1 g ∶20 mL。提取液经抽滤，于80 ℃浓缩至生药含量为 1 g/mL 的原液，于4 ℃冰箱密封保存，备用。

超声提取参照翁贵英等的方法[12]，提取时间为40 min。索式回流提取方法为70 ℃回流提取2次，每次1 h，合并2次提取液。浸提提取方法为70 ℃恒温水浴锅浸提2 h。

1.3.2供试菌种的活化及菌悬液的制备培养基的配制及供试菌的活化参照沈萍等的方法[13]。将活化的供试菌种转接后于37 ℃培养24 h，待菌体达到对数生长期后，用无菌生理盐水制成菌体浓度为10-6～10-7 CFU/mL 的菌悬液，待用。

1.3.3抑菌活性的检测采用滤纸片扩散法检测3种龙胆的抑菌活性。用6 mm打孔器打取1号定性滤纸片，灭菌后分别放入不同方法提取的3种龙胆草的提取液、阴性对照无菌水及阳性对照青霉素溶液中浸泡2 h，沥干待用。

配制培养基，倒平皿，冷却后每个平皿加50 μL菌悬液，用无菌三角涂布棒将其涂布均匀。将用不同药液浸泡过的滤纸片等距放置在涂有菌液的平皿上，于37 ℃培养24 h，设3次重复。用十字交叉法测量抑菌圈直径[抑菌圈直径包括滤纸片直径（6 mm），抑菌圈直径为6 mm表示无抑菌作用]，记录数据，取平均值。阴性对照无菌水无抑菌作用，阳性对照青霉素有抑菌作用，表明试验有效。抑菌圈直径越大，表示抑菌活性越强。

1.3.4最低抑菌浓度的测定对于用浸提法提取的粗提物，采用试管稀释法稀释后测定MIC[14]，分为大肠杆菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌3个大组，每个大组又分为3个小组，分别为头花龙胆、红花龙胆及翼萼龙胆组，每个小组取12支无菌试管，并编号为1～12，其中1～10号试管分别加1.00、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、1.95 mL培养液与1.00、0.80、0.70、0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05 mL 提取液，使提取液最终浓度分别为0.500、0.400、0.350、0.300、0.250、0.200、0.150、0.100、0.050、0.025 g/mL，再各加0.1 mL供试菌，混匀;11号试管加2 mL培养液与0.1 mL供试菌，记作CK1;12号试管只加2 mL粗提液，记作CK2。将全部试管于37 ℃培养24 h，取出振荡，观察各管细菌的生长情况。为了提高准确性，将初步判断为澄清透明的试管溶液涂布于平板培养基上，置于37 ℃培养24 h，再次观察，将完全无细菌生长的平板对应的粗提物浓度作为最低抑菌浓度。

1.3.5氧化剂对3种龙胆草抑菌活性的影响用浸提法提取获得龙胆草粗提液，供试菌为铜绿假单胞菌。参照“1.3.3”节的方法，根据抑菌圈直径的大小检测抑菌稳定性。

将原液制成含0.075% H2O2的样液，以原液与0.075% H2O2为对照。

1.3.6温度对3种龙胆草抑菌活性的影响将原液分别于40、60、80、100 ℃水浴及121 ℃高压湿热条件下处理30 min，以未加热处理的原液作为对照。

1.3.7pH值对3种龙胆草抑菌活性的影响将原液用 1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调成pH值为2、4、6、8、10、12的溶液，以未调pH值的原液作为对照。

1.3.8紫外线对3种龙胆草抑菌活性的影响将原液分别于15 W紫外灯下照射30、60、90、120 min，以未经紫外线处理的原液作为对照。

2结果与分析

2.13种龙胆草的超声提取物的抑菌活性比较

由图1中3种龙胆草超声提取物对3种细菌的抑菌圈直径可知，阴性对照无菌水无抑菌作用，阳性对照青霉素有抑菌作用，可以认为试验有效。3种供试菌的抑菌活性由大到小排序为红花龙胆>头花龙胆>翼萼龙胆。可见3种龙胆草的超声提取物对铜绿假单胞菌的抑菌活性较强，对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较弱，红花龙胆的超声提取物对铜绿假单胞菌的抑菌活性最强，抑菌圈直径为（14.14±1.70） mm。

2.23种龙胆草浸提提取物的抑菌活性比较

由图2可知，3种龙胆草对对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌活性的排序为红花龙胆>头花龙胆>翼萼龙胆，而对铜绿假单胞菌的抑菌活性排序为红花龙胆>翼萼龙胆>头花龙胆。头花龙胆浸提物对3种菌的抑菌活性大致相当;红花龙胆浸提物对3种菌的抑菌活性排序为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>铜绿假单胞菌;翼萼龙胆浸提物对3种菌的抑菌活性从强至弱排序为铜绿假单胞菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌。综上可以看出，浸提提取的红花龙胆浸提物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径为（14.66±0.82） mm。

2.33种龙胆草回流提取物的抑菌活性比较

由图3可知，3种龙胆草的回流提取物对大肠杆菌的抑菌效果排序为头花龙胆>红花龙胆>翼萼龙胆，对铜绿假单胞菌的抑菌效果排序为红花龙胆>头花龙胆>翼萼龙胆，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果排序为头花龙胆>翼萼龙胆>红花龙胆。回流提取的红花龙胆提取物对铜绿假单胞菌的抑菌作用较强，抑菌圈直径为（13.54±1.81） mm。

此外，本研究还对黑曲霉与根霉进行了抑菌试验，结果表明，3种龙胆草提取物对黑曲霉、根霉无抑制作用。综上所述，3种方法提取的头花龙胆粗提物的抑菌活性大致相当;红花龙胆用超声法与浸提法所得提取物的抑菌活性相当，用回流法得到的提取物的抑菌活性稍弱;翼萼龙胆用3种方法得到的提取物的抑菌作用也大致相当。由于3种提取方法的效果大致相当，所以下列试验采用成本低廉的浸提法提取。

2.43种龙胆草浸提液的最低抑菌浓度

由表1可知，头花龙胆浸提液对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的MIC为0.100 g/mL，红花龙胆浸提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC为0.050 g/mL，对铜绿假单胞菌的MIC为0.100 g/mL;翼萼龙胆浸提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC为0.150 g/mL，对铜绿假单胞菌MIC为0.100 g/mL。

2.5氧化剂对3种龙胆草浸提液抑菌稳定性的影响

由图4可知，3种龙胆草浸提液的抑菌圈直径排序为原液+氧化剂（H2O2）>H2O2>原液，其中头花龙胆浸提液经氧化剂（H2O2）处理后活性增加的最多，抑菌圈直径达（23.12±1.18） mm，说明氧化剂能够增强龙胆草浸提液的抑菌活性。3种龙胆草浸提液的抑菌成分受氧化剂的影响较小，可能因为氧化剂本身对细菌就有抑制作用。

2.6温度对3种龙胆草浸提液抑菌稳定性的影响

由图5可知，与原液相比，随着温度的升高，龙胆草浸提液的抑菌活性逐漸降低，但降低幅度较小。总体上可以看出，头花龙胆与红花龙胆浸提液的抑菌稳定性较高，在100、121 ℃ 时仍具有较高的抑菌活性。翼萼龙胆的抑菌稳定性稍低于头花龙胆、红花龙胆。综合以上结果可以得出，3种龙胆草的抑菌成分对热的稳定性较好。

2.7pH值对3种龙胆草浸提液抑菌稳定性的影响

由图6可以看出，在pH值为2～12的范围内，3种龙胆草浸提液的抑菌活性呈现先升高后降低的趋势，但是下降幅度较小，在pH值为4时抑菌活性达到最大值，说明3种龙胆草[CM（25]浸提液的抑菌成分受到pH值的影响较小。此外由图6可以看出，酸性环境能提高龙胆草的抑菌活性，碱性环境则会降低龙胆草浸提液的抑菌活性。

2.8紫外线对3种龙胆草浸提液抑菌稳定性的影响

由图7可以看出，随着紫外线处理时间的增加，3种龙胆草浸提液的抑菌活性逐渐下降，但是下降幅度较小。紫外线处理30 min时，3种龙胆草的抑菌活性与对照相比相差不大;紫外线处理90 min时，翼萼龙胆的抑菌活性变化仍然很小，表明翼萼龙胆的稳定性较高。综合以上结果可以看出，3种龙胆草的抑菌成分对紫外线较稳定。

3讨论与结论

提取粗提物的方法很多，有回流法、浸提法及超声提取法等。李世传等认为，金银花的超声法与索式法提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果略好于普通回流法[15];张雅静等通过对苦瓜抑菌作用的研究，认为抑菌效果从好至差排序为超声提取法>回流提取法>浸提法[16]。本试验通过对超声、回流、浸提3种提取方法的比较，认为头花龙胆与翼萼龙胆用3种方法所得提取物的抑菌效果大致相当，而红花龙胆的超声法与浸提法所得提取物的抑菌效果大致相当，回流法所得提取物的抑菌效果稍弱。说明不同植物用不同方法所得提取物的抑菌效果不尽相同。

原江锋等认为，连翘提取物经氧化剂处理后，抑菌活性大为降低，其对氧化剂的抑菌稳定性较弱[17];本试验表明，氧化剂处理可使3种龙胆草的抑菌活性增强，说明氧化剂对3种龙胆草提取物抑菌活性的影响较小，3种龙胆草对氧化剂的稳定性较好。3种龙胆草提取物对高温具有较好的热稳定性。用紫外线照射3种龙胆草提取物，其抑菌活性仍然较高，说明3种龙胆草的抑菌成分对紫外线较稳定。3种龙胆草提取物在酸性环境下的抑菌活性较强，在pH值为4的活性最大，在碱性环境中时，龙胆草提取物的抑菌活性逐渐降低，但是下降幅度较小，与任晓静等对甜叶菊[18]、仇燕等对菜芙蓉的研究结果[19]具有一致性。不同的是仇燕等研究得出，菜芙蓉提取物随着pH值的升高，其抑菌活性的下降速度变快[19]。

清热解毒中草药具有一定的抑菌作用，从抑菌效果来看，翼萼龙胆草浸提物对铜绿假单胞菌的抑菌作用好于头花龙胆草浸提物，回流提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果好于红花龙胆，而红花龙胆具清热、解毒的功效，说明翼萼龙胆也可以作为清热解毒的药物使用。

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