生地大黄汤通过干预紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1对自发性高血压大鼠脑出血模型脑水肿的改善作用❋

江 珊，俞晓飞，栗春梅

(上海中医药大学附属曙光医院神经内科、神经病学研究所，上海 201203)

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是临床常见脑血管疾病，其高致残率、高致死率严重影响患者的生活质量及生存指数，发病率占全部脑卒中的10%～15%，发病30 d死亡率接近50%，是第二大卒中类型[1-2]。脑出血后继发一系列病理损害，其中最主要的是各种因素诱发的脑水肿，其严重程度是急性脑出血预后的重要预测指标[3-5]。Claudin-5、Occludin、Zo-1是血脑屏障结构中主要的紧密连接蛋白，对于维持血脑屏障功能，防止脑水肿至关重要[6]。本研究旨在研究生地大黄汤对自发性高血压大鼠脑出血模型脑水肿的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级自发性雄性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)，由上海中医药大学实验动物平台采购自北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号SCXK(京)2016-0006)，年龄3～4月，体质量(300±20) g。采用动物无创血压测试仪(尾套法)测量收缩压，收缩压达到180～200 mmHg。饲养于上海中医药大学实验动物中心，标准饲料喂养，自由进水，动物房7∶00～19∶00光照周期模拟昼夜交替，相对湿度55%，温度22 ℃。本实验已通过上海中医药大学实验动物伦理委员会审查(伦理编号为PZSHUTCM170721001)。

1.2 主要仪器与试剂

生地大黄汤由生地黄、生大黄(上海中医药大学附属曙光医院中药房)按3∶1比例水煎醇提浓缩制得，每毫升药液中含2 g生药；Occludin兔多克隆抗体(abcam,ab222691)、Claudin-5兔多克隆抗体(abcam,ab15106)、ZO-1兔多克隆抗体(abcam,ab216880)；乙醇、水合氯醛(武汉博士德生物工程有限公司)；脑立体定位仪(江湾Ⅰ型)；微量进样器(上海高鸽科技有限公司)；MRI设备(PHILIPS-7D978E6，Philips Medical Systems)；电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；手术器械、电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)等。

1.3 脑出血模型建立

采用大鼠自体血注入法建立脑出血模型，具体模型建立和筛选步骤见前期已发表论文[7]。

1.4 分组与干预

27只SHR大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和生地大黄汤组各9只。假手术组只开颅钻孔进针，后2组采用大鼠自体血注入法建立脑出血模型。造模后6 h生地大黄汤组灌胃生地大黄汤(18.5 g/kg/d)，假手术组和模型组灌胃等体积纯水，每天1 次，连续干预3 d。

1.5 神经功能缺损评分

造模后3 h、1d、3 d各组取9只大鼠，按Longa 五级评分法[8]进行神经功能缺损评分；其中0分为无神经功能缺损，1分为动物不能完全伸直其前肢，2分为动物一侧肢体瘫痪并有追尾现象，3分为动物不能站立、打滚，4分为无自发性活动、有意识障碍。造模后评分1～3 分认为脑出血造模成功。

1.6 脑水肿体积MRI检测

造模后3 d各组取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，将大鼠俯卧于大鼠线圈进行MRI扫描，评估脑出血大鼠脑水肿情况，具体参数为T1：TR/TE=550/15，T2：TR/TE=4000/112，SL:2，FOV:100。根据系统自带软件勾画计算脑水肿体积。

1.7 脑含水量测定

造模后3 d各组取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉，生理盐水灌流心脏后取大鼠全脑，电子天平称取湿重；电热恒温箱内70 ℃烘烤72 h，称取干重。以(湿重-干重)/湿重×100%计算脑含水量，评价脑水肿程度。

1.8 Western blot检测血肿周围组织紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1

造模后3 d各组取3只大鼠取材。样本离体后液氮速冻，-80 ℃冰箱内保存。选取血肿周围脑组织，称重20 mg，按试剂盒说明书进行匀浆、离心提取蛋白抽提液并测定浓度，电泳、转膜、加一抗过夜，TBST清洗5 min×3次，加二抗，TBST清洗15 min×5次，显影、曝光并扫描分析。

1.9 统计学方法

2 结果与分析

2.1 对神经功能缺损评分的影响

表1显示，造模后3 h、1d，生地大黄汤组神经功能缺损评分与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模后3 d,生地大黄汤组神经功能缺损评分低于模型组(P<0.05)。

2.2 对脑水肿的影响

表1图1显示，造模后3 d，模型组及生地大黄汤组大鼠可见血肿周围脑水肿形成，其中生地大黄汤组脑水肿体积明显轻于模型组(P<0.05)。

图1 造模后3 d MRI检测大鼠脑水肿(T2:TR/TE=4000/112,SL:2,FOV:100)

2.3 对脑含水量的影响

表1显示，造模后3 d，模型2组较假手术组脑含水量增加，生地大黄汤组较模型组脑含水量明显降低(P<0.05)。

2.4 对血肿周围组织紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1的影响

表1图2显示，造模后3 d，模型组(ICH)、生地大黄汤组(RRD)紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1表达水平较假手术组(SHAM)降低(P<0.05)，生地大黄汤组Claudin-5、Occludin、Zo-1表达高于模型组(P<0.05)。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分、脑水肿程度、紧密连接蛋白/β-actin比较

注：与假手术组比较：#P<0.05；与模型组比较：*P<0.05

图2 Western blot检测脑出血大鼠血肿周围脑组织Claudin-5、Occludin、Zo-1的含量

3 讨论

脑出血后血肿周围脑组织水肿是主要的继发性病理表现，由血脑屏障破坏引起的细胞外液体聚集导致血管源性水肿在脑水肿形成过程中至关重要[9]。血脑屏障由内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞和基质构成，其中内皮细胞通过紧密连接蛋白相连[10]。Claudin-5、Occludin、Zo-1是紧密连接蛋白的主要成分，敲除Claudin-5基因小鼠的血脑屏障通透性增加，降低Occludin、Zo-1表达同样加大了血脑屏障的渗透性[6]。

中医药治疗急性出血性中风历史悠久，并积累了丰富的临床经验。近年中医药因其多靶点、多途径治疗特点而备受关注。生地大黄汤为治疗血证的著名古方，首见于唐·孙思邈《千金翼方》，药用生地黄、生大黄。生大黄是治疗急性脑出血的常用药物[11]，其泻热毒、破积滞、行瘀血可改善血液循环，降低颅内压，减轻脑水肿。单味中药生地注射液对脑出血大鼠具有促神经修复及抗神经细胞凋亡作用[12]。生地黄甘寒滋阴止血，生大黄苦寒清热活血，由生地黄和生大黄组成的古方生地大黄汤，用于治疗急性出血性中风，共奏清热滋阴、止血活血之功用。

本研究旨在探讨生地大黄汤对自发性高血压大鼠脑出血模型脑水肿的影响及其可能机制。结果显示，大鼠脑出血模型造模后神经功能缺损明显，加用生地大黄汤3 d，生地大黄汤组神经功能缺损显著改善；大鼠脑出血模型造模后脑水肿体积、脑含水量明显上升，加用生地大黄汤3 d，生地大黄汤组脑水肿体积减小，脑含水量明显减轻。大鼠脑出血模型造模后血肿周围脑组织Claudin-5、Occludin、Zo-1表达下降，加用生地大黄汤3 d，生地大黄汤组Claudin-5、Occludin、Zo-1蛋白水平表达上升。表明生地大黄汤对自发性高血压大鼠脑出血模型脑水肿程度有明显的改善作用，能减少脑水肿体积，降低脑组织含水量，缓解神经功能缺损，而其可能的机制与生地大黄汤干预紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1相关。