不同活血化瘀方剂对心衰大鼠心功能及MMP-2的影响❋

张 洋，王志娟，张 艳，刘晓宇△，孔繁达

(1. 大连医科大学附属第二医院中医科，大连 116000； 2. 航天中心医院，北京 100049；3. 辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032； 4. 辽宁中医药大学，沈阳 110032)

心力衰竭(简称心衰) 是各种原因引起的心脏结构和功能变化，即以心室重构为主要改变的心脏泵血功能障碍，临床上以肺循环瘀血和(或)体循环瘀血及组织血液灌注不足为主要表现[1]。基质金属蛋白酶2(MMP-2)作为基质金属蛋白酶家族的重要成员，与心衰的发生发展关系密切；当心衰发生时，MMP-2的表达和活性逐渐增强，MMP-2的含量水平与心衰进程成正相关[2]。本实验研究选用ACEI类药物中的赖诺普利作为阳性对照药物，ACEI为治疗心衰的基石类药物，研究显示ACEI可抑制心衰时MMP-2的表达，并通过抑制心室重构及改善心功能达到防治心衰的作用[3-4]。活血化瘀类中药作为临床治疗心衰的有效方药，可显著缓解心衰症状，改善心脏功能，提高患者生活质量[5-6]。桃红四物汤为活血化瘀类基础方剂，血府逐瘀汤、补阳还五汤等诸多活血化瘀方剂均由此方化裁而来。目前鲜见活血化瘀方剂对心衰后心功能及MMP-2影响的相关研究报道。本研究旨在观察不同活血化瘀方剂对心衰大鼠心功能及心肌中MMP-2的表达影响，从中筛选出疗效突出的方剂，并探讨其作用机制及靶点，为中医药防治心衰提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验所需动物由辽宁长生生物技术有限公司提供[SCXK(辽)2010-0001]。选用12周龄、普通级、健康、雄性SD大鼠100只，体质量220～260 g。

1.2 造模与分组

图 1、2显示，大鼠经7 d适应性喂养后，按每100 g给予10%水合氯醛0.4 mL行腹腔注射麻醉。备皮后于左侧第4肋间开胸，钝性分离胸部肌肉，暴露肋骨，钝性分离肋间组织剥离心包膜暴露心脏，于左冠状动脉前降支起点处结扎冠状动脉前降支，重置心脏于胸腔，分层缝合胸壁。术后连续注射青霉素钠3 d以预防感染。常规喂养1周后将饲料减半，同时每日游泳至其力竭，每日1次，共4周；行心脏超声检测大鼠左室射血分数(LVEF)，计算心脏指数(CI)；以LVEF≤50%或CI≤180 ml·min-1·kg-1作为心衰成功造模的标准[7-8]。将造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、赖诺普利组、桃红四物汤组、血府逐瘀汤组、补阳还五汤组，未行冠脉结扎的大鼠为空白对照组，每组各10只大鼠。

图1 空白对照组与造模后大鼠心脏超声比较

1.3 药物与给药剂量

桃红四物汤组由桃仁、红花、当归、川芎、赤芍、熟地等中药组成，补阳还五汤组由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁等组成，血府逐瘀汤组由桃仁、红花、川芎、赤芍、当归、生地、牛膝、桔梗、柴胡、枳壳、甘草等组成，中药方剂制剂由天江药业有限公司提供，处方中的全部药材均符合《中国药典》2010年版有关规定[9]。赖诺普利片(10 mg/片)产自信谊万象药业(国药准字H10960265)。空白对照组与模型组灌胃蒸馏水3 mL/次，每日1次。各给药组大鼠按人鼠剂量换算，给药剂量(g/kg)=给出的人的剂量(g)×系数(0.018)/所求动物体质量(kg)[10]。各中药组给药为9.2 g生药/kg，赖诺普利组给药为1.5 mg生药/kg，给药组药物均溶于3 mL蒸馏水中，每日1次灌胃，上述各组均灌胃6周。

1.4 检测方法

给药4周后行心脏超声检测各组大鼠的心功能，包括：左室收缩末期容积(ESV)、左室舒张末期容积(EDV)、射血分数(LVEF)、每搏输出量(SV),遂处死全部大鼠，每只大鼠心脏按标准处理，取100 mg心肌组织标本，于液氮中冷冻后再保存待测,分别用于免疫组化法及实时定量荧光PCR检测心肌组织中MMP-2的表达。

1.4.1 心肌免疫组化学检测 3%H2O2去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，磷酸缓冲液(PBS) 冲洗2 min×3次；分别滴加一抗MMP-2受体抗体(稀释比例1∶300)，37 ℃孵育 1 h，PBS 冲洗2 min×3次；滴加兔抗山羊IgG抗体，室温孵育30 min，PBS 溶液冲洗2 min×3次；DBA显色，显微镜下观察并控制反应时间，待组织着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液；蒸馏水充分冲洗，苏木精轻度复染，乙醇脱水、透明、中性树胶封片。以心肌胞质染成棕褐色为阳性细胞标志，采用Imagepro-Plus 6.0图像分析软件测定心肌组织切片阳性表达区的积分光密度值(IOD)，取平均值作为IOD。

1.4.2 心肌实时定量PCR检测 采用TRIZOL从心肌组织中提取总RNA(100 mg/mL)，提取方法严格按照说明书操作。在逆转录反应体系中加入RNA 2μg，10×RT Mix2μL，NTP混合液2 μL，OligodT152 μL，QuantReverse Transcriptase 1 μL，加入RNase-free水。逆转录反应体系在37 ℃下反应60 min，在70 ℃下15 min使产物变性。合成的cDNA于-20 ℃下保存。MMP-2上游引物 5’-GAAGCATCAAATCGGACTG-3’，下游引物5’-GGCGGGAGAAAGTAGCA-3’，产物长度251 bp。PCR反应条件均为:95 ℃预变性5 min 94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s,重复35个循环后,72 ℃ 5min。梯度稀释的正常组cDNA，以各引物完成定量PCR反应，再将各组cDNA进行定量PCR检测。实时定量PCR数据统计采用相对定量法。以2-ΔΔCt(Livak)法比较未经处理样品和已处理样品目标转录之间的表达差异。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠心功能检测结果

表1显示，与空白对照组比较，模型组ESV、EDV明显升高，LVEF、SV明显下降(P<0.05)；各给药组ESV、EDV较模型组明显下降,LVEF、SV明显升高(P<0.05)。给药组组间比较，补阳还五汤组较其他3组ESV、EDV明显下降，LVEF、SV明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组大鼠MMP-2免疫组化IOD值及mRNA表达结果

表1图2显示，与空白对照组比较，模型组心肌组织MMP-2的IOD值及mRNA表达均明显升高(P<0.05)；各给药组MMP-2水平较模型组差异有统计学意义(P<0.05)。给药组组间比较，补阳还五汤组MMP-2的IOD值及mRNA水平较其他3组下降更为显著，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，空白对照组及各给药组MMP-2的阳性表达明显减少(P<0.05)；与补阳还五汤组比较，其他3给药组MMP-2的阳性表达明显升高(P<0.05)。

表1 各组大鼠心功能、MMP-2免疫组化IOD值及mRNA表达结果

注：与空白对照组比较：▲P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与补阳还五汤组比较：#P<0.05

注：A.空白对照组；B.模型组；C.赖诺普利组；D.桃红四物汤组；E.血府逐瘀汤组；F.补阳还五汤组图2 (A～F) 各组大鼠心肌组织MMP-2免疫组化染色 (40×)

3 讨论

“心衰”作为病名首见于西晋·王叔和《脉经·脾胃部第三》：“心衰则伏，肝微则沉，故令脉伏而沉”[11]。现代医学的心衰与中医文献记载的心衰尚存在一定差异，属于中医学“胸痹、水肿、喘证、心悸”等范畴。中医古代文献对于心衰的命名只是抓住了心衰的一些临床症状进行阐述，而不是将心衰作为一个独立的疾病，不利于反映心衰作为一个疾病发生发展的全过程。目前多主张以“心衰病”命名，更有利于体现其疾病特征[12]。临床中心衰以“血瘀”证候为主要表现，“不通则痛”决定了心衰的病因病机主要为“血瘀”所致，故活血化瘀视为心衰的基础治则。本研究选用桃红四物汤、血府逐瘀汤及补阳还五汤作为研究药物，三方均为活血化瘀类代表方剂。桃红四物汤以祛瘀为核心，辅以养血行气，使瘀血祛、新血生、气机畅，化瘀生新为该方显著特征。血府逐瘀汤与补阳还五汤皆由桃红四物汤化裁而来。其中血府逐瘀汤主治诸症皆为瘀血内阻胸中、气机郁滞所致，即王清任所称“胸中血府血瘀”之证。补阳还五汤方中重用黄芪以补气，使得气帅血行；另配地龙引领活血化瘀诸药贯通经脉以达末节之地，故此方更偏于益气活血、化瘀通络。

心室重构是心衰发生发展的核心机制。心室重构是心室由于心肌损伤或负荷(压力或容量)加重等因素，导致心肌结构发生改变和心脏功能下降等一系列复杂的病生理过程。心室重构主要表现为心室肥厚、心室腔扩大等心肌结构的改变[13]。本研究通过心脏超声检测大鼠心功能发现，模型组大鼠ESV、EDV明显升高，LVEF、SV明显下降，说明心衰大鼠出现心室腔扩大、左室增厚、心脏收缩功能下降等心肌结构和功能改变，提示大鼠存在心室重构。经药物治疗后大鼠心肌结构及功能均有明显改善，表现为ESV、EDV明显下降及LVEF、SV明显升高，说明中药桃红四物汤、血府逐瘀汤、补阳还五汤和西药赖诺普利在治疗心衰过程中均起到了抗心室重构和改善心功能的作用，且补阳还五汤效果优于桃红四物汤、血府逐瘀汤及赖诺普利。

研究表明，心衰时心肌组织中MMP-2的表达显著增高，高表达的MMP-2可降解正常胶原组织，使心肌胶原网络发生重构，进而导致心室重构恶化，从而加快心衰的进程[14]。而通过下调心衰时心肌MMP-2的表达，可有效改善心功能，抑制心室重构，进而达到治疗心衰的作用[15]。本研究发现，中药桃红四物汤、血府逐瘀汤、补阳还五汤和西药赖诺普利均可下调心衰大鼠心肌中MMP-2的表达，其中补阳还五汤在下调心肌MMP-2的表达上优于桃红四物汤与血府逐瘀汤及赖诺普利。本研究表明，上述中药活血化瘀方剂可通过改善心衰时受损的心脏功能及抑制心肌MMP-2的表达起到治疗心衰的作用，其作用机制可能是通过抑制心肌MMP-2活性，从而调节心肌胶原的分布及代谢，修复受损心肌组织，增强心肌的抗牵拉性和弹性，从而提高心肌整体收缩力，改善心功能，抑制心室重构，进而达到治疗心衰的作用。本研究佐证了“活血化瘀”治则在治疗心衰中的重要意义，为“通则不痛”的中医理论提供了科学客观的实验依据。