纳米钽种植体对兔胫骨修复部位微环境影响

郝春波 王周凯欣

种植体修复是口腔牙列的缺损与缺失重要的治疗方法，如何提高种植体的成功率成了最为主要的问题，对患者种植体修复能够成功起到了决定性的作用[1]。种植体与牙槽之间通过骨合作用形成牢固结合，种植体表面的化学修饰对整个骨结合的过程具有实质上的影响，通过改变表面的化学成分，金属材料会具备更加高的生物活性，从而有效地促进与骨组织之间的愈合状态[2]。钛种植体是目前最常采用的一类种植体，在临床获得广泛的应用[3]。但随着口腔医学的发展，钛种植体的许多问题得以暴露，如何进行骨的诱导效应以及生物活性亦或是寻找更加有效的金属种植体更了医学界的研究热点[4]。研究显示钽金属与机体有非常好的生物相容性，可以和成骨细胞发生一定的结合反应，且不会引起机体发生中毒等不良反应[5]。本实验将比较了纳米钽种植体与纯钛种植体在植入兔胫骨后对修复部位微环境的影响，力求为纳米钽种植体在人体内的成骨结合作用提供微环境融合方面的借鉴。

1 材料与方法

1.1 动物

30 只5 月龄新西兰大白兔，均为雄性，2～3 kg，常规喂养，随机分为纯钛种植体组与纳米钽种植体组，每组15 只。

1.2 试剂与材料

单面刀片、蜡铲、台木、切片机、切片刀、毛笔、蜡带盘、水浴锅、染色缸、载玻片(Beyotime公司)；苏木素染液(Leagen公司)；PCR仪、实时荧光定量PCR仪7500型(ABI公司，美国)；0.25%胰蛋白酶消化液、青霉素、链霉素(Gibco公司，美国)；RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，德国)；TaqMan反转录试剂盒、2×TaqMan快速通用PCR反应液(Applied Biosystems公司，美国)；4%戊巴比妥溶液(SIGMA公司，美国)及由生工生物工程上海股份有限公司合成引物(表 1)。

表 1 引物名称及序列

1.3 方法

1.3.1 胫骨种植体植入[6]5 月龄雄性新西兰大白兔30 只，随机分为纯钛种植体组与纳米钽种植体组(n=15)。耳缘静脉注射30 mg/kg戊巴比妥钠全麻下，在双侧胫骨近心端离胫骨头(0.5～1.0 mm)骨嵴内侧骨面，以球钻定位，先锋钻裂钻制备出宽3.3 mm深度为8.0 mm的洞形。将纯钛种植体与纳米钽种植体拧入骨组织，末端平齐骨缘，分层严密缝合，术后抗炎3 d，进行常规喂养。

1.3.2 种植体周围组织学取材 术后每组在1、4和8 周各处死2 只新西兰大白兔，注射过量4%戊巴比妥，在种植体周围环形切取软组织，储存于-80 ℃冰箱内保存。

1.3.3 形态学切片制作和观察 4%多聚甲醛固定新西兰白兔种植周围组织标本，常规制片，苏木精、伊红染色。中性树胶封后于显微镜下观察。

1.3.4 荧光定量PCR检测 取术后1 周时处死的大白兔的种植体周围软组织，采用RNeasy Mini Kit提取总RNA，逆转录反应合成cDNA，反应条件为：25 ℃ 30 min→42 ℃ 30 min→85 ℃ 5 min。以cDNA为模板，采用2×TaqMan快速通用PCR反应液进行荧光定量检测PCR，反应条件：95 ℃ 3 min→(95 ℃ 30 s→64.5 ℃ 45 s→72 ℃ 1 min)×40 个循环，4 ℃保温，于62 ℃时采集荧光信号。以GAPDH作为参比，计算TNF-α、IL-6与IL-1β mRNA表达水平，相对含量=2-△△Ct，其中△△Ct=△Ct样本目的基因-△Ct样本GAPDH。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 术后种植体周围组织形态变化分析

本研究2 组新西兰大白兔均存活，且种植体周围骨组织与种植体接触界面上有着较好的整合；通过对2 种种植体术后1、4、8 周的组织学观察，可以发现2 组在术后1 周均有较多的中性粒细胞浸润，相对于纯钛种植体组的生长变化，纳米钽种植体组在4 周后有较多的新骨层，到第8周，能看到更大面积的基质骨的形成；HE切片染色显示图显示纳米钽种植体组具有更好的成骨细胞生长性，种植体与周围组织形态的切合率更高(图 1)。

2.2 种植体周围软组织TNF-α、IL-6与IL-1β mRNA表达情况分析

纳米钽种植体组种植体周围软组织中促炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平均显著高于纯钛种植体组(P<0.05)，2 组IL-6的mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)(图 2)。

3 讨 论

钽材料在医学领域中逐渐表现出良好和广泛应用性，大量实验数据证实钽植入人体后不会造成损伤，肌肉组织切片在钽材料上有着良好的生长分裂，充分证实钽金属与机体有非常好的生物相容性[7]。因此自从上个世纪40年代开始这种金属逐渐在医学各专业上得到了很好的推广与应用，从心脏起搏器、修复神经的金属丝、骨头缺损的修复方面均能看到它发挥作用的身影，在医学领域的应用越来越受到关注[8]。这都为钽作为口腔医学种植体的应用做了很好的铺垫研究。目前尚缺少纳米钽金属种植体植入后修复部位炎症反应和微环境变化的研究报道，本研究将纳米钽金属种植体与传统使用的纯种钛种植体进行了对比，力求为纳米钽种植体在人体内的成骨结合作用提供微环境融合方面的借鉴。

图 1 2 组种植体术后种植体周围组织形态学改变 (HE)

Fig 1 Morphological changes of the microenvironment around implants in the 2 groups (HE)

图 2 术后1 周2 组种植体周围软组织炎性因子mRNA水平比较

Fig 2 Comparison of mRNA levels of inflammatory factors in soft tissue around the implants between the 2 groups 1 week postoperation

本研究结果显示2 组材料种植体周围骨组织与种植体接触界面上均有着较好的整合，通过对2 种种植体术后1、4、8 周的组织学观察，可以发现2 组在术后1 周均有较多的中性粒细胞浸润，相对于纯钛种植体组的生长变化，纳米钽种植体组在4 周后有较多的新骨层，到第8周，能看到更大面积的基质骨的形成；HE切片染色显示图显示纳米钽种植体组具有更好的成骨细胞生长性，种植体与周围组织形态的切合率更高。提示纳米钽种植体在一定的培养时期后，出现新的骨层以及更大面积基质骨的几率更大，初步证明了纳米钽种植体在口腔种植体中较钛金属的优势所在。

本研究通过对2 种种植体周围软组织术后1 周后的TNF-α、IL-6 与IL-1β mRNA 的表达水平比较，发现促炎因子TNF-α、IL-1β在纯钛种植体组的表达水平显著高于纳米钽种植体组要高出许多，两组IL-6表达水平无显著差异，提示纳米钽种植体组的种植体术后炎症反应较纯钛种植体组低，显示纳米钽种植体术后发生种植体周围炎风险更低，充分说明了纳米钽种植体与周围的骨组织具有较好的融合性，成骨细胞的排斥性更低，侧面证实后后期骨结合效率的有效提高性。种植体周围组织中一旦发生炎症，这些炎症能够迅速地从周围组织向结缔组织甚至骨组织中发展，而在牙周组织中的发展要明显慢得多[9-10]。

综上，纳米钽种植体组的种植体术后炎症反应较纯钛种植体组低，从而推测纳米钽种植体术后发生种植体周围炎风险更低。