进口白羽肉种鸡禽白血病疫情鉴定

2019-08-19马美哥于蒙蒙许传田黄庆华孟照洁王素艳邢立晓常芳芳何希君刘长军祁小乐王永强孙延鸣王笑梅高玉龙

中国预防兽医学报 2019年5期

马美哥，于蒙蒙，许传田，黄庆华，孟照洁，王素艳，邢立晓，常芳芳，李猷，何希君，刘长军，祁小乐，王永强，孙延鸣，王笑梅，高玉龙

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队，黑龙江哈尔滨150069；2.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南250100；4.山东和康源生物育种股份有限公司，山东济南271018)

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup，ALV)引起禽类的多种恶性或良性肿瘤性疾病的统称，以在成年鸡中产生淋巴样肿瘤和产蛋量下降为主要特征。J 亚群ALV (ALV-J)是近年来一种致病性更强和传播能力更快的新的外源性ALV，主要引起肉用型鸡发生骨髓细胞瘤[1]。由于AL 危害严重，被《国家中长期动物疫病防治规划(2012 年～2020 年)》列为优先防控的动物疫病。由于该病是重要的种源性疾病，也被《全国兽医卫生事业发展规划(2016 年～2020 年)》列为重点净化的家禽疫病。经过近些年的持续净化，国内AL 得到了较好的控制，尤其在蛋种鸡场的发生率逐年降低，但目前在部分地方品种鸡群仍有感染和流行[2]。

目前我国白羽肉鸡祖代鸡主要依靠进口，进口肉种鸡的种源安全除了直接关系到我国鸡肉产品安全生产外，也对国内家禽生物安全带来很大挑战[3-4]。2018 年以来，辽宁、山东等地某品种进口白羽肉种鸡发生了严重的疑似AL 病例，主要发生在17 周龄～19 周龄的父母代肉种鸡，导致种蛋孵化率下降，大量肉种鸡被淘汰，损失非常严重。为了分析引起该次白羽肉种鸡发病的病原，本研究从白羽肉种鸡发病鸡场采集疑似病料样品，通过病理切片、病毒分离、病毒亚群鉴定等试验，证实所有分离株均属于ALV-J，确诊了引起该次白羽肉种鸡发病的病原。

1 材料与方法

1.1 病料样品与细胞 2018 年5 月～7 月，山东、辽宁等地的白羽肉种鸡父母代场出现了疑似AL 病例，发病日龄多在17 周龄～19 周龄，可见病鸡肝脾肿大，肝破裂，肝脾有肿瘤，发病率高达30 %。从发病场先后采集6 批共55 份病鸡肝、脾、肾等组织脏器样品。用于病毒分离培养的DF-1 细胞以及大肠杆菌感受态DH5a 均由本实验室保存。用于鉴别ALV 亚群的多重PCR 的A、B 和J 亚群ALV 阳性对照质粒由本实验室制备和保存[6]。

1.2 主要试剂 Ex DNA 聚合Taq酶、pMD18-T 载体、DL2000 DNA Marker 均购自TaKaRa 公司；DNA 提取及胶回收试剂盒购自AXYGEN 公司；ALV p27 抗原检测试剂盒购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

1.3 病理剖检与组织切片的观察对疑似发生肿瘤病的进口白羽肉种鸡剖检，观察其器官病变。取病鸡的肝脏和脾脏样品参照徐镔蕊等[5]的方法制备病理组织切片，HE 常规染色后，二甲苯树胶封固，显微镜下观察切片。

1.4 肿瘤病病原的检测将发病鸡的肝脏和脾脏病料样品，至研钵中充分研磨，离心后取上清，按试剂盒的方法提取其基因组DNA，以其为模板，采用ALV 多重PCR 引物及马立克氏病病毒(MDV)、网状内皮增生症病毒(REV)特异性引物[6-7]，对ALV、MDV 及REV 进行PCR 扩增。

1.5 ALV 亚群的鉴定与序列分析将1.4 中鉴定为ALV 阳性的病料样品上清经0.22 μm 的滤器过滤除菌，接种于70 %～80 %单层的DF-1 细胞，按常规方法培养盲传2 代，收获DF-1 细胞上清用于ALV p27 抗原的检测，检测为ALV 阳性的细胞上清提取其DNA 用于鉴别ALV 亚群的多重PCR 检测[6]，同时设A、B 和J 亚群ALV 质粒作为阳性对照[6]。PCR 产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，并克隆于pMD18-T 载体，经PCR 鉴定正确后由吉林省库美生物科技有限公司测序。利用DNAStar 中SeqMan 软件对序列进行剪辑、拼接，并利用MegAlign 软件构建系统发育树，与国内外不同亚群ALV 病毒株序列进行比对与遗传进化分析。

2 结果与讨论

2.1 病理剖检与组织切片观察剖检后可见病鸡肝脏显著肿大，表面弥漫着大量细小的白色增生性结节，肝脏周围有充满血液的囊泡状物，类似血管瘤，在脊椎、骨膜处有肉瘤样赘生物。

组织切片观察显示，与正常肝组织切片相比，发病鸡肝实质中存在弥漫性或局灶性髓细胞样瘤细胞浸润。肝组织正常结构被破坏，肝索消失或排列紊乱，残余肝细胞变性、坏死。脾实质内可见团块状增殖的肿瘤细胞，伴有部分肿瘤细胞坏死(图1)。

图1 发病鸡肝脏、脾脏的病理组织学变化(HE 染色)Fig.1 Pathological changes of liver and spleen of diseased chickens(HE staining)

2.2 肿瘤病病原检测结果提取55 份病料样品的总DNA，利用ALV、MDV、REV 的特异性引物进行PCR 扩增，结果显示ALV 阳性样品12 份，阳性率为21.8%，MDV 阳性样品1 份，阳性率为1.82%，REV 均为阴性。表明引起进口白羽肉种鸡发病的病原主要为ALV。

2.3 ALV 亚群的鉴定结果将12 份经PCR 扩增为ALV 阳性的病料样品接种DF-1 细胞培养，盲传2代，收集细胞上清，利用ALV p27 抗原ELISA 试剂盒检测(判断标准：S/P 值>0.2 为阳性，S/P 值≤0.2为阴性)。结果显示，有8 株病毒细胞上清呈阳性(S/P 值为0.399～2.208)，另外4 份细胞上清ELISA检测结果呈阴性，整个过程细胞状态良好，推测可能是该4 份病料样品中病毒含量太低，导致病毒接种DF-1 细胞后未增殖起来。结果呈阳性的8 株病毒分别命名为：SD1801、SD1802、SD1804、SD1805、SD1806、SD1807、SD1808 及SD1809。

分别提取8 个分离株细胞上清的前病毒DNA，以其为模板，进行ALV 亚群的多重PCR 检测，结果显示，8 个分离株均扩增出与ALV-J 相对应的约422 bp 的目的条带(图2)，初步表明，8 个分离株均为ALV-J。

图2 分离的8 株ALV 多重PCR 检测结果Fig.2 The detection result of the 8 isolates by multi-PCR detection

2.4 序列分析结果将2.3 扩增得到的约422bp 的ALV-J 特异性基因PCR 产物经测序结果显示，8 个分离株之间同源性为99.5 %～100 %，与A、B、C、D 亚群ALV 的同源性仅为56.5 %～58.8 %，与ALV-J 的同源性最高，为90.7 %～96.6 %。遗传进化分析显示，8 个分离株与ALV-J 属于同一分支(图3)。表明8 个分离株均属于ALV-J。该结果与多重PCR 检测结果一致，综合病理剖检与组织切片观察、鸡群临床症状及多重PCR 检测结果，进一步确定了引起进口白羽肉种鸡发生严重肿瘤病的病原为ALV-J。

近年来，虽然蛋鸡发生了严重的AL[8-11]，但白羽肉鸡很少有ALV-J 流行的报道。2018 年以来山东某些白羽父母代肉种鸡发生了严重的AL，该次发病鸡主要是不同地区多个养殖场养殖的进口某品种肉种鸡，虽然发病地域和鸡场不同，但这些鸡场均是从国外某个品种白羽祖代肉鸡场引进的父母代肉种鸡，品种相同，来源相同，所以从这些发病特点来看，很可能是由于该品种的白羽祖代肉鸡感染了ALV。该次AL 疫情发病率高、范围广，是近年来我国白羽肉种鸡发病最为严重的一次。该次所有发病鸡场的种鸡均来源于同一个品种的白羽祖代肉鸡场，尽管祖代鸡AL 来源还没有确定，但根据ALV的传播特点，其与祖代鸡引进很可能有极大的关系，建议有关部门，将AL 等种源性疾病纳入到进口祖代鸡的必检项目，严把进口种源疫病关，防止疫病随进口动物传入我国，影响我国的动物安全生产。