嗜酸乳杆菌发酵复方中药成分变化对腹泻小鼠的影响

谷 巍，孙明杰，王丽荣，陈 振，曾佳佳，陈 静，徐海燕，单宝龙，王春凤

(1.山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室，山东泰安271000；2.吉林农业大学动物科学与技术学院/吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林长春130118)

发酵是中药材传统炮制方法之一。对中药发酵，在提高药物效能、产生新的化合物、降低药物毒性等方面具有显著优势[1]。刘颖等研究表明中药天龙发酵后可增强其对肺腺癌A549 细胞的抑制作用[2]。Xing 等研究表明真菌G.luteus发酵丹参能够显著提高其抗氧化活性和总酚含量[3]。孙佳彬等比较发酵前后半夏的毒性和刺激性变化，发酵后的半夏比未发酵半夏对家兔眼结膜的刺激性明显减弱，发酵可以缓和半夏的刺激性[4]。本实验以具有涩肠、止泻、抑菌、消炎作用的3 味中药组成中药复方，经嗜酸乳杆菌发酵中药复方后，利用高效液相色谱(HPLC)对中药复方发酵前后成分的变化进行比较、分析。以大肠杆菌K88 引起的腹泻小鼠为实验对象，对比研究中药复方发酵液与中药复方水提液对腹泻小鼠的影响，为中药复方发酵液深入应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 中药复方由乌梅、五倍子、蒲公英组成，乌梅、蒲公英由山东舜生堂中药饮片有限公司生产，质量标准符合《中国药典》 (2010 年版)，生产批号1507402，1409377；五倍子由亳州市贡药饮片厂生产，质量标准符合《中国药典》(2015版一部)，生产批号为20151201。产肠毒素大肠杆菌K88 菌株购自中国兽医药品监察所。嗜酸乳杆菌由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院分离，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏专利号：201102872925。甲醇、磷酸、磷酸二氢铵、乙腈，色谱纯，均购自天津凯通。100 只6 周龄～8 周龄BALB/c 小鼠，雌雄各半，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)201400077。MRS 乳酸菌液体培养基、LBS乳酸菌固体培养基、EMB 肠杆菌、和BS 双歧杆菌培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。IFN-γ、IL-4 试剂盒购自山东邦奕生物科技有限公司。

1.2 中药复方发酵液成分变化的测定 中药复方水提液制备：中药蒲公英、乌梅、五倍子烘干，磨粉，过80 目筛，按蒲公英、乌梅、五倍子6∶1∶1 比例精确称取，传统水煎炮制方法，提取40 min，65 ℃烘干。精确称取8 g 烘干粉末置于100 mL 嗜酸乳杆菌菌液中，超声震荡30 min，即为中药复方水提液。

中药复方发酵液制备：中药蒲公英、乌梅、五倍子烘干，磨粉，过80 目筛，按蒲公英、乌梅、五倍子6∶1∶1 比例精确称取8 g 烘干粉末置于100 mL MRS 液体培养基中接种嗜酸乳杆菌液(3×109cfu/mL)4 mL，37 ℃，发酵24 h 即为中药复方发酵液。

采用HPLC 测定不同发酵时间点的色谱峰，比较主要色谱峰的变化。发酵过程中从开始，每小时取发酵液2 mL，共取13 次发酵液，均置于4 ℃保存。取样结束后所有样品12 000 r/min 离心10 min，上清液经0.22 μm 滤膜过滤，滤液为待测液。

1.3 实验动物分组及处理 按基础日粮预饲实验小鼠3 d 后随机分为4 组：发酵组、水提组、模型对照组、空白对照组，每组24 只，雌雄各半。将1.2制备的中药复方发酵液和中药复方水提液浓缩后冻干制备冻干粉，分别按0.4 g/只/d 添加于基础日粮，制备成中药发酵鼠粮和中药水提鼠粮。基础日粮配方及营养成分参考文献[5]。分组后即开始饲喂试验，模型对照组和空白对照组饲喂基础日粮，发酵组饲喂中药发酵鼠粮，水提组饲喂中药水提鼠粮，持续饲喂7 d 结束试验。饲喂期间，第1 d～4 d除空白对照组外其余3 组灌胃林可霉素(15 mg/mL)和头孢曲松钠(25 mg/mL)两种抗生素，破坏肠道正常菌群平衡[6]，0.3 mL/次/只，2 次/d，第5 d 腹腔注射大肠杆菌K88 菌悬液0.3 mL/只(2.7×108cfu/mL)。空白对照组灌胃和注射等量盐水。腹腔注射后开始观察小鼠腹泻情况，统计直至第7 d 试验结束。动物饲养室温20 ℃～25 ℃，湿度55 %～65 %。

1.4 小鼠腹泻率和腹泻指数的统计 在试验第5 d，腹腔注射大肠杆菌菌悬液前，每组各取10 只小鼠，单笼饲养管理。在小鼠腹腔注射大肠杆菌第6 h、24 h、27 h、36 h 时根据参考文献观察统计每只小鼠是否腹泻、总便数、稀便数、稀便级别，计算腹泻率和腹泻指数[7]。

1.5 小鼠免疫器官指数的测定 试验结束(第7 d)，对小鼠称重后断颈迫杀，剥离脾脏、胸腺、肝脏，分别称重，计算免疫器官指数。脾脏指数= 脾脏重量(g)/体重(g)×100，胸腺指数、肝脏指数计算方法与上述计算方法相同。

1.6 小鼠肠道菌群的测定 饲喂7 d 试验结束时，断颈迫杀小鼠。无菌采集小鼠盲肠内容物，用无菌生理盐水倍比稀释，将不同稀释度的0.1 mL 稀释液涂布于各种鉴别培养基上：EMB 培养基用于鉴别大肠杆菌，37 ℃有氧培养24 h 后进行菌落计数；LBS和BS 培养基用于鉴别嗜酸乳杆菌和双歧杆菌，37 ℃培养48 h 后进行菌落计数，统计结果用每克肠道内容物鲜样中细菌个数的对数lg (cfu/g)表示。

1.7 小鼠细胞因子IFN-γ、IL-4 的测定 试验第5 d，腹腔注射大肠杆菌前、注射后2 h、24 h、36 h 取1.4 单笼饲养的10 只小鼠断尾采血，冷藏过夜，4 000 r/min，离心10 min，分装血清，用试剂盒分别检测小鼠血清IFN-γ、IL-4 表达水平，计算IFN-γ/IL-4 的比值。

1.8 统计分析 采用SPSS17.0 统计软件进行数据方差分析，显著差异者用LSD 方法进行多重比较，结果均用平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 中药复方发酵液成分变化测定 HPLC 测定发酵液样品0～12 h 发酵过程中每小时色谱图变化情况，从0～12 h 测定的13 个色谱图中选定3 h、6 h、8 h、12 h 样品色谱图叠加。结果表明发酵12 h 内，在保留时间为16 min (发酵前色谱峰)和10.5 min(发酵后色谱峰)出现主要的两个特征吸收峰的变化。发酵前色谱峰不断降低，发酵后色谱峰不断升高，两个峰处于此消彼长的变化趋势(图1)。表明两个主要吸收峰对应的两种物质存在转化关系。

图1 3 h、6 h、8 h、12 h 中药复方发酵液色谱叠加图Fig.1 Chromatographic superposition diagram of fermentation broth for 3 h, 6 h, 8 h and 12 h

2.2 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠腹泻率和腹泻指数的影响 用抗生素连续给小鼠灌胃4 d 后腹腔注射大肠杆菌K88，观察记录小鼠各时间点腹泻情况。结果显示注射大肠杆菌后0～36 h 期间，模型对照组、发酵组与水提组3 组小鼠的腹泻率均呈现降低趋势，在36 h 时，发酵组腹泻率最低(4%)，低于水提组(24 %)，模型对照组也存在自愈现象，但腹泻率仍然较高(87.5 %)(图2)。结果表明中药复方发酵液能够明显降低小鼠的腹泻率，对小鼠腹泻有较好的治疗作用，治疗效果优于中药水提液。

图2 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠腹泻率的影响(%)Fig.2 Effect of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on diarrhea rate in diarrhea mice (%)

在小鼠腹腔注射大肠杆菌6 h、24 h、27 h 和36 h 时，观察统计小鼠排便情况，计算腹泻指数。结果显示模型对照组腹泻指数与空白对照组差异显著(p<0.05)。在6 h 和24 h，中药发酵组与水提组腹泻指数差异不显著(p>0.05)，但数值低于水提组。在27 h 和36 h，发酵组腹泻指数显著低于模型对照组和水提组(p<0.05)(表1)。结果表明，在降低腹泻指数方面，中药复方发酵液优于中药复方水提液。

表1 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠腹泻指数的影响Table 1 Effect of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on diarrhea index in diarrhea mice

2.3 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠免疫器官的影响 试验结束时，剖检小鼠取其脾脏、胸腺、肝脏，称重。结果显示发酵组及水提组小鼠的免疫指数均高于空白对照组及模型对照组，且与模型对照组相比，发酵组的脾脏指数、胸腺指数及肝脏指数分别提高了48.37 % (p<0.05)、29.57 % (p<0.05)、36.99 % (p<0.05)，且高于水提组。水提组相对于空白对照组略有升高，但未到达显著性差异(图3)。结果表明中药复方发酵液能够更好的促进免疫器官发育。

图3 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠免疫器官的影响Fig.3 Effects of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on immune organs in diarrhea mice

2.4 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠肠道菌群的影响 试验结束时，无菌采集小鼠盲肠内容物，活菌计数测定盲肠中大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸菌数量。结果显示，注射大肠杆菌后36 h，与空白对照组相比，模型对照组大肠杆菌数量显著升高(p<0.05)，双歧杆菌数量显著下降(p<0.05)，乳酸菌数量有所降低。表明注射大肠杆菌K88 后，肠道有害菌开始增殖，有益菌生长受到抑制。小鼠饲喂中药后，发酵组和水提组大肠杆菌数量均与模型组相比显著降低(p<0.05)，且发酵组大肠杆菌数量显著低于水提组(p<0.05)，双歧杆菌和乳杆菌数量显著高于模型组(p<0.05)，且发酵组双歧杆菌数量显著高于水提组(p<0.05)，乳酸菌数量与水提组差异不显著(p>0.05)(图4)。结果表明饲喂中药复方饲料能够抑制大肠杆菌的生长，促进益生菌的生长，且发酵组优于水提组。

图4 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠肠道菌群的影响Fig.4 Effect of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on intestinal flora in diarrhea mice

2.5 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠血清IFN-γ 水平的影响 在小鼠腹腔注射大肠杆菌前(0)、后2 h、24 h、36 h 4 个时间点断尾采血，分离血清。试剂盒测定不同时间点小鼠IFN-γ 含量。结果显示IFN-γ 含量呈先下降后上升趋势。注射大肠杆菌前(0)，发酵组与空白对照组差异不显著(p>0.05)，水提组和模型对照组与空白对照组差异显著(p<0.05)。注射大肠杆菌2 h 后，模型对照组、发酵组与水提组均低于空白对照组，且差异显著(p<0.05)。注射24 h，发酵组与空白对照组差异显著，其余各组与空白对照组差异不显著。注射36 h 后各组间无显著性差异(图5)。结果表明发酵中药在注射大肠杆菌前能够抑制IFN-γ 的降低，在注射大肠杆菌后能促进IFN-γ 迅速提高，恢复平衡。

2.6 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠血清IL-4 水平的影响 在小鼠腹腔注射大肠杆菌前(0)、后2 h、24 h、36 h 4 个时间点断尾采血，试剂盒测定不同时间点小鼠IL-4 含量。结果显示不同时间点小鼠血清IL-4 含量呈先上升后下降趋势。注射大肠杆菌前模型对照组与其它3 组均差异显著(p<0.05)，而在注射大肠杆菌不同时间点，发酵组与水提组差异均不显著(p>0.05)(图6)。表明注射大肠杆菌后，IL-4 含量上升，中药无论发酵与否均能抑制这种变化。

图5 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠血清IFN-γ 水平的影响Fig.5 Effects of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on serum IFN-γ levels in diarrhea mice

图6 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠血清IL-4 水平的影响Fig.6 Effects of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on serum IL-4 levels in diarrhea mice

2.7 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠血清IFN-γ/IL-4 的影响 根据已经测定IFN-γ 和IL-4 含量，计算IFN-γ/IL-4。结果显示发酵组IFN-γ/IL-4 更接近空白对照组，有降低IFN-γ/IL-4 比值向Th2 方向转化。感染24 h 后，各组小鼠的IFN-γ/IL-4 不同程度升高，但发酵组能够迅速提高IFN-γ/IL-4 比值，使其更接近空白对照组，使已经发生的Th2 方向的转化迅速恢复平衡(图7)。表明中药复方发酵液在调节细胞因子平衡方面优于中药复方水提液。

3 讨 论

图7 嗜酸乳杆菌发酵中药复方对腹泻小鼠血清IFN-γ/IL-4 的影响Fig.7 Effects of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on serum IFN-γ/IL-4 levels in diarrhea mice

中药种类繁多，成分复杂，经发酵后成分更难确定。中药在畜牧行业中已经有许多应用[8-10]，但中药发酵方面应用报道较少。研究报道，中药中的一些成分经过发酵后含量增加1～4 倍，并且产生了某些新的特征吸收峰，同时发酵前的几个特征吸收峰消失，但未明确新形成物质和消失物质间的关系[11]。本实验在发酵过程中在保留时间为16 min 时产生了主要特征吸收峰，在10.5 min 产生了新的吸收峰，对0～12 h 间隔取样的测定结果表明两者确实存在此消彼长的转化关系。发酵过程中，中药成分的变化，会引起药效的变化。如仲桢玉研究表明，葛根发酵后总成分减少，但降糖能力有所提高；天花粉发酵之后活性物质含量和抗氧化降糖能力均优于原料，发酵中药复方产生了积极的作用[12]。Han 等对比研究了发酵苦参和非发酵苦参对LPS 诱导的大鼠葡萄膜炎模型(EIU)的影响，发现发酵可以提高苦参的抗炎作用[13]。本实验研究表明发酵中药复方成分的变化也对腹泻小鼠产生了积极的影响。

动物试验结果表明，中药复方发酵液对腹泻小鼠在腹泻率、腹泻指数、免疫器官指数、肠道菌群微生物、提高IFN-γ/IL-4 比值方面均优于中药复方水提液。卢伟等研究黄芩与鼠李糖乳杆菌发酵产物对仔猪大肠杆菌腹泻治疗效果表明，发酵产物组腹泻率、粪便计分、肠病变程度均低于其它治疗组[14]。李国忠研究表明芽孢杆菌发酵黄芩在提高仔猪免疫球蛋白方面显著高于未发酵黄芩，TNF-α、IL-4 含量较空白组提高了90.7 %、78.3 %[15]。其有益效果的产生可能与中药发酵物中的鼠李糖乳杆菌和发酵产物或芽孢杆菌及芽孢杆菌代谢物产生有关。本实验在对其进行K88 所致腹泻小鼠研究中，为了减少嗜酸乳杆菌及发酵产物对试验效果的影响，将等量嗜酸乳杆菌发酵液浓缩后与中药复方水提液混合冻干，减少益生菌及代谢产物的影响，说明中药复方发酵液优于中药复方水提液，主要是因为中药复方发酵后成分的变化。其中保留时间为16 min 时产生的主要特征吸收峰在嗜酸乳杆菌的发酵下，随时间推移，发生了此消彼长的转化，是发酵前后色谱峰的主要变化。因此推测这种转变，是发酵后有效成分提升的原因。

蒲公英的主要成分为绿原酸、咖啡酸等[16]。乌梅主要成分为枸橼酸、柠檬酸。五倍子的主要成分为单宁酸[17]。我国药典中收载的五倍子鞣质，称为鞣酸(Tannic acid)，又叫单宁酸。五倍子的鞣质含量很高，最高可达70 %以上。这3 种中药中，具有转化成分的为单宁酸。一个单宁分子与n 个水分子参加反应，在酸性条件下，加热水解得到一个葡萄糖分子(C6H12O6)和n 个(n 可能为6、7 或8)没食子酸分子(C7H6O5)[18]。在工业上，没食子酸主要由单宁酸的酸、碱、酶水解而来。因此推测，在发酵过程中的转化可能为单宁酸与没食子酸间的转化。在之后试验中，将乌梅、五倍子和蒲公英单独用嗜酸乳杆菌发酵，确定了发酵前未知峰来源于五倍子。但以没食子酸为标品，进行液相色谱分析时，其保留时间并未与未知峰重叠。因此未知峰的成分分析需要借助液质连用色谱进一步分析。

乌梅、五倍子、蒲公英中药复方经嗜酸乳杆菌发酵后，中药成分有所变化，其在降低产毒素大肠杆菌K88 引起的腹泻小鼠的腹泻指数和腹泻率，提高小鼠免疫器官指数，修复肠粘膜并维持肠道菌群平衡，快速消除小鼠体内炎症方面，优于中药复方水提液，为开发防治因产肠毒素大肠杆菌所致的仔猪腹泻相关中药发酵产品提供实验依据，也为其作用机理的深入研究提供参考。